AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒

                              AxyPrep-96 DNA凝胶回收试剂盒 
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至 8 μg 长度在 70 bp-10 kb 的片段，回收率为 60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液（DE-A溶液）中熔化，其中的保护剂能防止线状 DNA在高温下降解，然后在 DE-B溶液的作用下使 DNA选择性地结合到膜上。纯化的 DNA纯度高，并保持片段完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。 
 
一、试剂盒组成、贮存、稳定性 
Cat. No. AP-96-GX-1 AP-96-GX-4 AP-96-GX-24 
制备次数 1×96 prep 4×96 preps 24×96 preps 
96-well DNA plate- A 1 4 24 
96-well 2.2 ml growblock 2 8 48 
96-well V-bottom sample plate 1 4 24 
Adhesive film 3 15 75 
Silicone mat 1 4 24 
Buffer DE-A 40 ml 165 ml 2×480 ml 
Buffer DE-B 29 ml 80 ml 480 ml 
Buffer W2 concentrate 72 ml 2×72 ml 6×150 ml 
Eluent 10 ml 25 ml 110 ml 
说明书 1 1 1 
96-well DNA plate- A：96孔 DNA制备板。 
Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含 DNA保护剂，防止 DNA在高温下降解。室温密闭贮存。 
Buffer DE-B：结合液（促使大于 70bp 的 DNA选择性结合到 DNA制备膜上）。室温密闭贮存。 
Buffer W2 concentrate：去盐液。*使用前，必须按试剂瓶上的体积加入无水乙醇（可用 100%
乙醇或 95%乙醇），充分混合后使用。每次使用后需将瓶盖盖紧，以保持W2中的乙醇含量。 
Eluent：洗脱液，室温密闭贮存。 
二、注意事项 
1. Buffer DE-A（含有β-巯基乙醇）和 Buffer DE-B含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和防护眼
镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理
盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 
2. 在步骤 1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线性 DNA长时间暴露在高温条件
下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA
造成的损伤。 
3. 在步骤 2中凝胶必须*熔化，否则将严重影响 DNA回收率。 
4. DNA 分子呈酸性，建议在 2.5 mM Tris-HCl，pH7.0-8.5的洗脱液中保存。 
三、实验准备 
1. 准备无核酸和核酸酶污染的 Tip 头。
2. *次使用前，在 Buffer W2 concentrate中加入体积的无水乙醇。 
3. 准备 75 °C 水浴。 
4. 使用前，检查 Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于 75 °C 温浴加热至沉淀*溶解并冷
却至室温后再使用。 
四、操作步骤 
1. 用干净锋利的刀片从琼脂糖凝胶中切下含有目的 DNA 条带的凝胶块，用纸巾吸尽凝胶表面液 
体并切碎。计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg=100 μl 体积），然后依次放入 96孔 2.2 ml深孔板（试剂盒内提供）孔中。 
 * 观察DNA条带位置时，请尽可能缩短紫外照射时间，以减少紫外诱导突变。电泳时间可适当延长，从而使目的DNA条带与其他DNA条带尽可能分开，从而提高回收纯度。 
 
2. 加入 3个凝胶体积的 Buffer DE-A，用硅胶片密封各孔（试剂盒内提供），混合均匀后于 75 °C温浴，间断混合（每 3-5 min），直至凝胶块*熔化（15 min左右）。3,000×g 简短离心使硅胶片上的溶液到 96深孔板中。 
* 温浴及混匀过程中，要确保硅胶片与深孔板贴紧，以免孔间样品污染。 
* Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否*熔化。 
 
3. 弃硅胶片。每孔加 0.5个 Buffer DE-A体积的 Buffer DE-B，用不干胶片（试剂盒内提供）密封各孔，混合均匀。3,000×g 简短离心使不干胶片上的溶液到 96深孔板中。当分离的DNA 条带小于
400 bp 时，应在此溶液中再加入 1个凝胶体积的异丙醇。 
* 加Buffer DE-B 后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。 
 
4. 将 96孔 DNA 制备板（试剂盒内提供）置于新的96孔 2.2 ml 深孔板（试剂盒内提供）上，然后将样品转移至 96孔 DNA制备板中，用不干胶片密封各孔，3,000×g 离心 5 min，弃滤液。 
 
5. 将 96孔 DNA 制备板置回深孔板上，每孔加800 ml Buffer W2，3,000×g 离心 1 min，弃滤液；以同样的方法，再用 800 ml Buffer W2洗涤一次，3,000×g 离心 1 min。 
 * 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的体积加入无水乙醇。 
* 两次用Buffer W2冲洗能确保盐分被*清除，消除对后续反应的影响。 
 
6. 将 96孔DNA制备板置回 96孔 2.2ml 深孔板上，3,000×g 离心 5 min。 
7. 将96孔DNA制备板置于洁净的96孔V型底板（试剂盒内提供）上，在膜正中央加50 ml Eluent或去
离子水，用不干胶片密封各孔，室温静置 5 min。3,000×g 室温离心 5 min洗脱DNA。 
* 将Eluent或去离子水加热至65℃，可提高洗脱效率。