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TA克隆实验原理 
发布时间:2016-09-12   点击次数:1110次
    TA克隆实验原理
    TA克隆是利用耐热聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端转移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校准活性,即在PCR产物的两个3 末端加上未配对的单一A凸出尾 ,质粒载体提供线性3末端单一的T凸出尾,使该载体能够直接与PCR产物连接。TA克隆技术比其它PCR克隆方法有更高的重组效率。
    TA克隆只需4个步骤:①扩增目的PCR产物;②制备T克隆载体;③PCR产物直接克隆至T载体上④转化并筛选重组子。
    TA克隆实验步骤
    (1)扩增后的PCR产物与T载体的连接
    取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。
    10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul
    PCR产物约0.3 pmol
    T载体约0.03pmol
    T4 DNA Ligase 1ul
    ddH2O 加至 25ul
    *1 DNA的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍。
    *2 相同末端的载体与DNA进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防止其自身环化。
    (2)盖好盖子,用手指轻弹Ep管数次,并于台式离心机离心2s 以集中溶液。
    (3)将反应管放入4℃金属浴中反应20h。
    (4)取出约2ul的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定连接结果,与未经连接的质粒DNA和酶切DNA一同作电泳。
    (5)用0.1×TE将连接混合物稀释至50ul,使用10ul转化大肠杆菌感受态细胞。
    (6)通过Amp抗性来筛选转化子,转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。

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