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PCR检测常见问题之假阳性分析
发布时间:2017-12-18   点击次数:457次
   PCR检测常见问题之假阳性分析
  利用PCR方法检测转基因成分时,经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论,有时可造成严重后果。为了提高转基因检测的准确性和可靠性,PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性,尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。
  本文对PCR检测中出现的假阳性原因进行分析
  (一)假阳性现象
  假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。
  (二)造成假阳性的原因
  1. 样品间交叉污染:样本污染主要有收集样本的容器被污染,或样本放置时,由于密封不严溢于容器外,或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染;样本核酸模板在提取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;
  2. PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
  3. PCR扩增产物污染:这是PCR反应中zui主要zui常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。
  4. 气溶胶污染:在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。
  5. 实验室中克隆质粒的污染:由于克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力,其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室,这个问题比较常见。

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