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让我们一起来了解一下亚克隆技术
发布时间:2019-03-25   点击次数:282次
  亚克隆技术是指在得到基因DNA片段的情况下,对其进行重新克隆,从而对目的基因DNA进行进一步的分析或者重组改造等。亚克隆技术也是分子克隆技术,这项技术的出现能够让人们对基因DNA序列有更深入的研究,明确基因的功能,从基因角度对生物体表型进行分析。
  亚克隆的技术流程主要分成四个步骤:目的片段的获取、酶切载体与目的片段的连接、转入宿主细胞和鉴定筛选。
  目的片段的获取
  获得目的片段的方法有以下几种方法:1、从基因文库中直接获取目的基因片段;2、运用PCR技术,以mRNA为模板逆转录而成cDNA序列,从而得到cDNA文库获取目的基因;3、使用限制性内切酶将供体DNA切成许多片段后导入到细胞中,经过筛选后得到含有目的基因的细胞;4、获得基因序列信息,在体外进行人工合成。
  酶切载体与目的片段的连接
  选择适宜的限制性核酸内切酶对载体目的片段序列进行剪切,通常情况下,会产生对称性粘性末端、不对称粘性末端和平末端三种情况。亚克隆实验中优先采用的是不对称粘性末端连接,可将外源DNA定向插入到载体中。
  转入宿主细胞
  将连接了目的基因的载体转入到细胞中通常有转化/转染以及转导两种方法。转化/转染是将重组质粒或噬菌体转入到经过处理的宿主细胞中;转导的方法是利用携带外源DNA的病毒类侵染宿主细胞。通常情况下,相比于转化的方法,转导的效率更高一些。
  鉴定筛选
  克隆细胞的筛选通常选用直接筛选的方法。载体带有可辨识的遗传标记,能够有效的将重组分子与原有细胞进行区分和分离。有些载体分子携带外源基因后,形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化,如蓝色变为无色,明显的颜色表型变化能够让重组分子得到明确的区分。除此之外,还有一些其他的药物筛选方法等,都可以比较简单的通过表型现象对克隆细胞进行有效的筛选。

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