荧光定量PCR的原理、方法及结果分析

　　荧光定量PCR的原理、方法及结果分析
　　自K. Mullis发明聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)以来，PCR技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。RT-PCR（实时荧光定量PCR技术）就是在PCR的基础上加入荧光基团，通过荧光信号的变化的实时监测PCR的反应过程，通过对未知模板进行定量分析的方法。目前，实时荧光定量 PCR 已成为不同样品间进行基因表达水平定量差异比较的权威性方法。在过去十几年中，该方法迅速流行，涉及科学的多个领域，包括农业、环境、工业和医学研究。
　　目前，qPCR技术已经广泛应用于疾病的早期诊断、遗传病的早期诊断、药物研究、肿瘤的诊断与研究、食品病原微生物的检测、转基因食品检测、动物疫病检测等，除此之外，还包括：
　　● 基因扩增
　　● 扩增特异性分析
　　● 基因定量分析
　　● 基因检测
　　● 基因分型
　　● SNP分析
　　● RFLP多态性分析
　　● 单/多基因表达研究
　　● 高通量基因表达谱研究
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　　（1）染料法
　　荧光染料可与双链DNA结合，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。同时，其缺点也在于其非特异性。当PCR反应中有引物二聚体或者非特异性扩增时，该染料也可以和这些非特异性扩增产物结合，发出荧光，从而干扰对特异性产物的准确定量。
　　常用的染料为SYBR Green I，各公司针对荧光信号强度、抑制作用等进行改进，也推出了很多新的染料供大家选择。
　　Promega采用新型荧光染料BRYT Green? Dye，对qPCR反应没有抑制作用，与双链DNA结合后荧光信号更强.
　　（2）探针法
　　在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。
　　（3）荧光定量
　　一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化;在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加，PCR终产物量与起始模板量之间没有线性关系，无法计算起始模板拷贝数。因此只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，故选择在这个阶段进行定量分析。为了定量方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了几个重要的概念：扩增曲线、荧光阈值、CT值。
　　注：
　　横坐标：代表扩增循环数;
　　纵坐标：代表荧光强度，每个循环进行一次荧光信号收集。
　　荧光阈值(Threshold)
　　在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光阈值的设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。(如下图)
　　每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。同时，对于荧光PCR实验来说，CT值也是判读样品阴阳性的重要指标。(如下图)
　　实验室应用
　　PCR检测方法在临床医学及实验室检验中最有价值的应用领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本有一个病原体存在，PCR方法就可以检测到。该方法对病原体的检测解决了免疫学检测的“窗口期”问题，常用于疾病的早期诊断，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。
　　大量的荧光定量PCR研究资料表明，病原体数量与感染性疾病病情的轻重程度、传染性及治疗效果均有相关性。因此，通过荧光定量PCR方法得到的检测结果，一定程度上可以准确反映疾病感染的情况。
　　除此之外，也可以见于肿瘤分子机制、遗传病筛查、样本成分鉴定等多方面的实际应用中。