制备微生物检测培养基细节问题
一、称取
用度1/100的电子天平称取培养基所需药品。先根据配方计算出配制一定量培养基所需各种成分药品的量,然后用天平准确称取。称量时用称量纸折叠成簸箕状盛放药品。称量纸折叠方法如图所示。
二、溶化
培养基放入烧杯或搪瓷缸中,慢慢加入少量所需水,边加入边用玻棒搅拌。如果培养基中不含有琼脂,培养基不需要加热;如果含有琼脂,则需要用本生灯或电磁炉加热煮沸,*溶解后,再补齐所需水,并搅拌均匀(如图3所示)。如果配制的培养基量很大,可用不锈钢锅加热溶化,可先用温水加热并随时搅动,防止焦化,如有焦化现象,配制的培养基就不能使用,要重新配制。
配制培养基时不可用铜或铁的容器溶化,因铜或铁制容器可能会使培养基中的铜和铁的含量超标,影响实验(培养基中铜含量大于0.3mg/L,细菌不宜生长,铁含量超过0.14mg/L,妨碍细菌产毒素)。对容易发生反应,产生沉淀的药品,要分开溶解,后面加入培养基,如磷酸氢二钾和硫酸镁。
三、调pH
虽然培养基中含有缓冲物质成分,能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内,但是配出的培养基若不符合要求,就要进行必要的调整。如果有已校准pH计,可用pH计,如果没有,可用精密的pH试纸,再根据需要用1 mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸(微调可用0.1氢氧化钠或0.1mol/L盐酸)调制所需的pH。培基的pH一般为7.4~7.6,也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压的培养基,在调整pH时要调至高出所需0.1个~0.2个单位,因用氢氧化钠调整时,高压后,培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分,可不pH。
四、过滤
配成的培养基,若无特殊要求,可省略此步。若有沉淀或浑浊.需要澄清的.液体培养基可用油纸过滤。而固体培养基可用中间夹一薄层脱脂棉的双层纱布过滤。如果过滤法还不能达到澄清的要求,则可用蛋清澄清法,即培养基加热冷却到50~60℃,装入三角瓶内(不超过容量的二分之一),按1000mL加人1个~2个鸡蛋的蛋清,用力摇晃3-5min,高压蒸汽121℃、20min,取出趁热过滤即可。
五、分装
配制好的培养基根据不同的用途分装在三角瓶、试管等容器中,分装试管,如果试管量很大,可用自动分液器,如果试管量少,可用漏斗分装。分装量不超过容器容积的三分之二。三角瓶以不超过容积的二分之一为宜;琼脂斜面以不超过试管长度的五分之一为宜,后,摆成的斜面为培养基量的三分之一,底层为三分之二的量为宜;半固体琼脂分装量为试管长度的三分之一;用来接种或保菌的高层琼脂,分装量为试管长度的四分之一或三分之一,用来接种厌氧菌的要达到三分之二;琼脂平板,内径为90mm的以13mL~15 mL为宜,内径70mm的平板为8mL~10 mL,制成的琼脂平板若表面水分较多,可将平板倒扣,放置在37℃培养箱内30min,干燥后再用。每批培养基应另外分装一小玻璃瓶(约20mL)与该批培养基同时,为测定该批培养基后面为pH。
六、
分装好的培养基应立即进行的方法种类如下:
1. 高压蒸汽法
大多耐热培养基都可用此法,小量分装时,用121℃,15min;量大时,用121℃,30min;含糖类的培养基只能113~115℃,15min,避免糖类遭破坏。
2.煮沸法
对含有不耐高温物质的培养基,可使用此方法。
3.过滤
以过滤的方法,用无菌操作技术,定量加入培养基。血液、抗生素可用无菌操作技术抽取,加入冷却到50℃左右的培养基中。培养基含有不耐热的物质时,可用此法。
对LST培养基进行时,有时发酵管内会有气泡。为防止发酵管内产生气泡,可以采取以下几项措施:
1. 小倒管浸满培养基(不留气泡)后再加入到盛LST的试管中。
2.锅关闭放气阀前,将锅内气体排干净。
3.试管塞不要塞得太紧(使用硅胶塞的时候),勿使用橡皮塞。
4不要过早打开锅,要等锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开锅。
如果以上情况都做到还有气泡,可用水做培养基组的对照试验,若培养基组有气泡,而对照组没有气泡可确定是培养基自身的原因。
七、倒平板
融化的培养基冷却到50℃后,倒入无菌干燥的培养皿中。培养基的温度不能过高,否则容易在培养皿的内盖上形成太多的冷凝水;温度太低,培养基又容易凝固成块,无法制成平板。倒平板时,应在靠近酒精灯火焰进行,以免外界的杂菌落入平板内,左手拿培养皿,右手拿三角瓶的底部,用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下,灼烧瓶口,用大拇指和食指把培养皿盖打开一条缝,至瓶口刚好伸入,倒入培养基,以铺满底为限,不超过培养皿高度的三分之一,迅速盖好盖,放在桌面上,轻轻地转动培养皿,使培养基分布均匀,冷凝后即可。
八、摆斜面
装在试管中的琼脂培养基,在完成后,趁热立即摆放在木棒(或玻璃棒)上,并成适当的斜度,冷却后,琼脂凝固即成斜面。斜面长度不用超过试管二分之一。
九、质量检查
培养基后仔细检查一遍,发现有破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染,都要丢弃,不能再用。并测定其后面为pH。还需进行无菌检查和效果检查。无菌检查是将后的培养基取1管(瓶)~2管(瓶),37℃恒温培养1d~2d,确定无杂菌生长;效果检查是用标准菌株接种在相关的培养基上检查检查菌的生长、形态及生化情况,与已知情况相符。两种情况都合格,配制的培养基方可使用。