实时定量PCR的原理、探测化学物质及探针优化

                         上海基屹生物阐述实时定量PCR的原理及探测化学物质

 

实时定量PCR原理

    对扩增产物进行可重复性的定量长期以来一直是科学家和研究者的目标。传统的方法需要对终产物进行凝胶电泳分析。这种方法可以确定目的产物和竞争产物的大小，估算纯度，计算条带强度。然而，所用扩增试剂和体系的变动会造成扩增的终产物的重复性有较大的变动，成为这种方法的主要弊端。扩增过程的指数期提供给我们zui有用的，可重复的数据。在起始的目的DNA量与循环过程的指数期的扩增产物量之间存在着定量关系。这正是实时扩增的基础。随着DNA内嵌染料和探针特异性化学的发展，实时探测量子学的跳跃发展推动了对扩增过程的研究进展。

    今天的实时设备由荧光读数计和热循环仪组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。在扩增的每个循环中至少收集一次荧光数据来进行扩增的实时监控。用户能够根据一个一个的循环知道那个样品正在扩增。这些即时的数据允许用户看清楚各个样本相对于标准品，阳性对照和阴性对照是如何扩增的。用户不仅能在扩增过程中监督整个反应，还可以根据反馈的信息来优化相应程序。因此增加了敏感性，特异性和有效性。

    正常化后的数据画成荧光值相对于循环数的对数图。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为zui大，这样可以获得zui准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。


探测化学物质

有5种主要类型的探测化学物质用于实时扩增，包括： 
1 内嵌染料 
2 双标记探针 
3 FRET探针 
4 分子信标 
5 Ampliflor

1内嵌染料（Sybr-Green I ）

内嵌染料，例如Sybr-Green I ，能与双链DNA结合 
a） SG不与单链DNA结合，荧光信号强度较低 
b） SG与双链DNA结合，荧光信号强度极大的增强

SG是一种荧光染料，能结合到DNA双螺旋的小沟。处于溶解状态的未结合染料显示低的荧光强度，一旦结合到双链DNA之后荧光信号增强。这种特性被利用在实时扩增中。由于在扩增反应中DNA增加，染料结合到扩增产物上，荧光信号增强。荧光信号相对背景水平的增加进行分析。根据扩增子的长度有多个荧光染料的分子结合到双链DNA上。内嵌染料可以所有其他传统扩增成分，例如水，缓冲液，MgCl2，dNTPs,Taq-聚合酶，引物和模板一起加到扩增反应管中。因为不需要设计序列特异性探针和新的引物对，这种方法是一种简便 ，性价比较高的实时监测方法。

内嵌染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。


溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰是凝胶电泳中条带的类似物。因此，用溶解曲线数据对SG反应后的产物进行质量监督。

2 双标记探针

双标记探针是一种短的寡核苷酸序列，5‘末端连接有荧光报告染料，3‘端连接有荧光淬灭分子。由于这种探针只有15-25bp长，报告基团和淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。在循环过程中，Taq DNA聚合酶对每个引物进行延伸。DNA聚合酶具有外切核酸酶活性，因此在延伸过程中会切除下游的探针。一旦探针被降解，报告染料就会与淬灭分子相分离。 
a） 报告染料R发射的能量被淬灭分子Q所吸收和淬灭。 
b） 聚合酶的外切核酸酶活性通过水解方式将报告染料与淬灭分子相分离导致了荧光信号的增加。

在每个扩增循环由于切开了探针因此实时设备探测到报告染料的增加。由于报告染料被切开，因此不能进行溶解曲线分析。双标记探针比内嵌染料有更高的特异性，这里有2个原因 ：
  首先，双标记探针具有序列特异性，只结合到互补区。

  第二个原因是双标记探针对每扩增的一个拷贝只释放一个分子的荧光染料。由于双标记探针增加了特异性，这种探测方法很适合检测低拷贝数的模板。


3．FRET 探针

FRET 
探针依靠荧光能量从一个荧光染料到另一个的传递。两个独立的特异寡核苷酸序列都标记上荧光基团。上游探针在3‘末端有一个供体基团，下游探针在5‘末有一受体基团。设计探针时他们在与目标序列结合时互相临近，使供体和受体荧光基团紧密接近。一旦探针杂交到模板上，从供体到受体荧光基团的能量传递产生了一个不同波长的荧光信号。供体荧光信号的减弱和受体荧光信号的加强都能分别监测到。因此，只有当两个探针都结合上去才能检测到荧光信号。FRET 
探针可以进行溶解曲线分析，对基因型分析，SNP检测和其他突变检测非常有用。

a） 扩增循环中，两个探针与靶DNA退火 
b） 供体被外部光源激发通过能量传递导致发射荧光的产生。

4 分子信标

第四种检测方法是分子信标（MB）。这种探针的基本特征是有一个发夹结构，在此结构的一个末端有一个荧光染料报告基团，在另一个末端有一个淬灭分子。 
这个发夹结构能使MB探针在不杂交时保持折叠状态，报告基团和淬灭分子处于接近的距离，几乎没有荧光信号发出。然而，当MB与模板杂交时，发夹结构被破坏，发色团不会被淬灭。在这个时间点，实时仪器能探测到荧光信号。用MB探针也可以进行溶解曲线分析。

a） 分子信标的发夹结构淬灭了荧光信号 
b） 杂交后开始发射荧光信号

得益于实时探测技术的实际应用数量和应用类型影响深远。其中的一些益处包括有机体的鉴定，诊断性检测，基因表达研究，突变检测，SNP检测，基因型和微阵列结果确证等。每种不同的化学物质根据应用的不同会提供给用户不同的便利。应该注意的是，得益于实时测技术并建立在荧光化学物质基础上的还有其他检测核酸的等温扩增系统。

5 AmplifluorTM直直接基因系统

AmplifluorTM直直接基因系统基本特征是激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。目标特异性AmplifluorTM直引物包含一个5‘内部互补序列，标记有荧光发色（fluorescerin）和一个能量受体：4-（二甲胺）氮-苯磺酸（DABSYL）。发夹结构的3‘端序列是目标特异性引物区。未结合的AmplifluorTM直引物由于内部荧光发色团和淬灭分子的紧密接近，只有低的荧光信号。

在*个循环中，Amplifluor引物1与特异CDNA的*条链退火并被Taq酶延伸。在 第二个循环中 
Amplifluor引物1延伸产物作为引物2（反义链引物）的模板。一旦引物2被Taq酶延伸，Amplifluor发夹引物解折叠并产生荧光信号。随后的扩增循环中产生的荧光信号的增强与扩增产物量的增加成比例。