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什么是TA克隆技术
发布时间:2015-09-02   点击次数:899次
 TA克隆技术(TA cloning)利用Taq聚合酶具有末端转移酶(TdT)活性,但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点,可在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。pMD18-T是一种克隆PCR产物的专用载体,它是由pUC18载体在Xba I和Sal I识别位点间插入一个EcoR V位点,然后用EcoR V进行酶切使质粒线性化,并在它的3'端添加“T”构建而成。因其3'端带有一个突出的“T”尾,能地与带“A”尾的PCR产物连接,极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物zui简便、快捷的方法。
  TA 克隆的idea zui初来自1994 年。几位学者发现Taq DNA聚合酶会在PCR产物的3’末端加上一个脱氧腺苷(A),而且这种特性与模板无关。之后,Invitrogen 公司发明了TA 克隆技术,并拥有全球TA cloning 商标的权,直至2013 年。线性化的T 载体在3’末端拥有一个脱氧胸苷(T),与PCR 产物的A 尾巴互补。原理就是这么简单。不过由于价格的原因,Invitrogen 的T 载体在国内却不是销量的。Promega 的pGEM-T(easy)和Takara 的pMD18-T 因性价比高,更加深入人心。
  TA 克隆的步骤无需赘述,相信大家都很清楚。无非就是PCR、连接、转化、鉴定这几个步骤,不过还有一些不得不说的问题,值得大家注意。
  1、用什么样的聚合酶?
  不是所有的聚合酶都会在PCR产物末端加A。具有3’到5’外切酶活性的高保真酶就不会产生A 尾巴。如果你下一步想要做基因表达,一定要用高保真酶,那也没问题。只要用Taq 酶在产物末端加个A 就OK。步骤也很简单,根本无需买个什么加 A 试剂盒,几步就搞定了。
  1. 用高保真酶扩增完之后,在反应管中加入 0.7-1 unit 的Taq 聚合酶。无需更换buffer,其中的dATP 已经够用。
  2. 在72℃孵育8-10 分钟。
  3. 立即进行纯化,沉淀、跑胶、或用纯化试剂盒。这一点相当重要,否则高保真聚合酶会将A 尾巴或T 载体上的T 尾巴切掉。
  有些率的聚合酶其实是Taq 酶和高保真酶的混合物,大约有一半的产物加了A 尾巴。所以你在克隆之前搞清楚你用的酶到底是否加 A,否则克隆出来白斑太少,又要讨论好久。
  2、PCR 产物的纯度
  如果你的PCR 产物只有*条带,恭喜你。不过为保险起见,还是用PCR 产物纯化试剂盒来纯化一次。否则白色菌落中的插入片段可能是引物二聚体哦。如果你发现有非特异条带,那优化一下PCR 反应,让非特异条带消失。跑胶纯化是下策,因为胶纯化可能会带走3’的A 尾巴。而且注意不要在紫外灯下暴露太久。只需5 秒,紫外对DNA 的伤害就足以检测;而长达60 秒的照射会让某段序列在测序时无法读取。问题远比你想象中严重。
  易生物提示:PCR 产物其实也有保质期。为了保证连接效率,PCR 产物不要超过一天。因为上面的A 尾巴会随着时间逐渐降解,导致连接效率下降。千万不要为了省事,就整个一大管 PCR 产物,每次用一点。zui终反而更浪费时间。
  3、载体和片段的比例
  这往往是影响克隆效果的zui大因素。通常来说,载体与片段的起始摩尔比为1:1。计算方法如下:
  X ng PCR 产物 = (ng 载体 × kb 片段大小) / kb 载体大小
  如果这样的比例不能令你满意,你可以在3: 1 到1:3 的范围内进行优化,选择zui佳的比例。 PCR 产物的浓度可以通过与Marker 比对估算出来。还有一种更准确的方法,用GE 的NanoVue 超微量分光光度计。只需要0.5 ul,就能测量出样品浓度,你再也不用舍不得珍贵的样品了。0.5 ul 而已,小意思。

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