如何完成western blot检测实验报告

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　　western blot检测服务（蛋白印迹杂交），又称免疫印迹(immunoblotting)，是用抗体检测蛋白的重要方法之一，主要利用抗原抗体反应，目前该技术已经发展的十分成熟，大多数实验室都已具备western blot检测的能力，但是如果想要得到一份真实客观。条理清晰的实验结果就需要我们花很大功夫，下面小编就为大家详细介绍一下关于western blot检测服务实验报告的一些操作。
　　1、蛋白质抽提
　　1）实验对象为组织样品，取适量（250-500mg）新鲜组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白。
　　2）实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白。
　　2、蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
　　3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)：将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进*个孔中，电泳分离蛋白。
　　4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜
　　5、膜的封闭和抗体孵育
　　1）膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
　　2）封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
　　3）加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
　　6、结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
　　7、数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
　　8、提供实验报告：包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。