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如何完成western blot检测实验报告

  • 发布日期:2015-11-18      浏览次数:2778
    •  本公司可为您提供专业的western blot检测服务,欢迎有需要的客户前来咨询。
        western blot检测服务(蛋白印迹杂交),又称免疫印迹(immunoblotting),是用抗体检测蛋白的重要方法之一,主要利用抗原抗体反应,目前该技术已经发展的十分成熟,大多数实验室都已具备western blot检测的能力,但是如果想要得到一份真实客观。条理清晰的实验结果就需要我们花很大功夫,下面小编就为大家详细介绍一下关于western blot检测服务实验报告的一些操作。
        1、蛋白质抽提
        1)实验对象为组织样品,取适量(250-500mg)新鲜组织样品,加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂),匀浆后抽提总蛋白。
        2)实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂(或核蛋白抽提试剂)抽提总蛋白。
        2、蛋白质定量:按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作,测定样品浓度。
        3、变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进*个孔中,电泳分离蛋白。
        4、蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜
        5、膜的封闭和抗体孵育
        1)膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
        2)封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时,抗原抗体结合。
        3)加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
        6、结果检测:化学发光法检测,膜与化学发光底物孵育,经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
        7、数据分析:目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差,所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
        8、提供实验报告:包括详细的实验方法及Western Blot实验结果。
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