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成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件
发布时间:2017-02-21   点击次数:475次
   成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件:
  凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析。
  吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将无法在膜上进行分析。
  处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上。
  处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如果蛋白质被掩盖则无法检测。
  成功进行Western Blot检测,则设置合适正确的对照是必不可少的,只要正确设置了这些对照,即可快速和准确的找到WB的问题所在,并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:
  阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率
  阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性
  二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性
  内参对照:检测标本的质量和二抗系统
  空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果
  Western Blot检测基本过程
  1、获取细胞或组织裂解物
  1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer:
  )选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!
  2、蛋白定量
  常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,进行免疫沉淀(IP)或者直接进行电泳分离蛋白
  3、电泳分离蛋白质
  根据待测蛋白状态确定电泳条件
  根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
  4、转膜
  根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率zui高。
  5、封闭
  去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有:含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
  6、一抗孵育
  一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:
  选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)
  选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证)
  选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
  一抗的保存和使用:
  根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入-20度保存,绝对避免反复冻融。
  抗体的工作液zui好现配现用,在4度保存zui好不要超过2周
  根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书推荐的稀释比例只作参考,需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然后选择信噪比zui好的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索zui佳稀释度(1:100-1:3000)。
  孵育条件:推荐4°C孵育过夜(一般大于18个小时),根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
  内参的选择和使用:WB过程监测以及目的蛋白定量的标准!
  7、二抗孵育
  根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索zui佳稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时
  8、底物孵育
  选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量
  9、结果分析和检测
  凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
  Note:从封闭开始,每步之间都需要用TBST进行洗涤,3次,每次5min

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