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腺病毒包装

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简要描述:

腺病毒(Adenovirus)是目前Z高效可靠的重组病毒表达系统之一,可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白。

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       腺病毒(Adenovirus)是目前zui高效可靠的重组病毒表达系统之一,可用于在哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白。其具备以下优点:
  1. 宿主范围广。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,除可感染几乎所有人的细胞类型外,还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。
  2. 因腺病毒的感染不依赖细胞周期,故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。
  3. 腺病毒具有嗜上皮细胞特性,因大多数肿瘤细胞均属于上皮细胞,这使得腺病毒非常适合应用于基因治疗领域。
  4. 病毒滴度高,可用于动物水平的实验。
  5. 有较好的生物安全性。腺病毒携带的基因不会整合到宿主细胞基因组中;实验中虽然会有一定机率出现RCA(即复制型腺病毒),但由于大多数成人体内都有针对腺病毒的抗体,所以一般危害不大。

技术要点

重组腺病毒的包装制备:重组腺病毒是从由侵染色斑组成单位(pfu)中分离获得的。一个单色斑是线性载体质粒转染后在20×15 cm板上由293A细胞连续侵染后被挑选和扩增形成的。重组腺病毒可通过超速离心纯化,并测定滴度及进行PCR鉴定。纯化后重组腺病毒的滴定浓度为1010pfu/ml,获得的量为2-4 ml。
重组腺病毒的特性:一般的,单个腺病毒通常是在30×150mm细胞培养皿中制备的。
获得量:1×10病毒颗粒/细胞
滴定浓度:1×1010~1×1012个病毒基因组/ml
zui终体积:1 ml纯化后的病毒液(储存于PBS)
储存:批量储存的zui佳条件为-80°C
几种病毒载体的区别:

腺病毒表达系统
慢病毒表达系统
逆转录病毒
病毒基因组成
双链DNA
单链RNA
单链RNA
载导容量
< 8 kb
< 8 kb
< 6kb
基因整合功能
无。病毒基因组游离于宿主基因组外,瞬时表达外源基因
有。病毒基因组整合于宿主基因组,长时间、稳定表达外源基因
有。
表达丰度
高水平表达
表达时间
快(1-2天)
慢(2-4天)
快(1-2天)
感染细胞类型
分裂和不分裂细胞
分裂和不分裂细胞。适用于难转染细胞
感染分裂细胞,但在干细胞中表达效率低
滴度TU/ml
10^12
10^9
10^9
四环素诱导系统
不可以
TET-ON , TET-OFF
不可以
毒性作用
细胞毒性
遗传毒性
遗传毒性
免疫原性
高免疫原性
低免疫原性
低免疫原性
动物模型
不能得到转基因动物
可产生转基因动物,效率达50以上
可以,但很难
安全系数
能否用于MIRCORNA
可以
可以
不可以
RNAi
病毒进入细胞往往引起细胞内干扰素反应,不适合做RNAi实验
适合,是RNAi实验的优选工具
可以用作RNAi实验
基因过表达
包装容量较大。可以满足较大基因的包装,是过表达基因的优选工具
包装容量有限,过表达的基因过大时,病毒滴度受到影响
包装容量有限,过表达的基因过大时,病毒滴度受到影响
常见应用
1、体外细胞基因转导2、基因治疗
1、体外细胞基因转导2、基因治疗
体外细胞基因转导,突变筛选,功能基因库构建 

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