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TA克隆(TA-cloning)

  • 发布日期:2013-11-09      浏览次数:3367
    •      TA克隆(TA-cloning)是利用Taq聚合酶的特性将PCR产物克隆的方法,又称为T-载体克隆

           Taq DNA聚合酶在四种dNTP存在下可以向非特性的PCR产物的3’末端特异性的添加一个A。这也成为Taq酶催化的PCR产物不能的连接至平末端载体的主要原因。相反地,如果此时有一个线性的带有粘性T末端的载体DNA(T载体),那么带有A粘性末端的PCR产物就可以的插入载体DNA中。这种方法被称为TA克隆。

       

      实验材料

      Invitrogen公司提供的TOPO 快速TA 克隆试剂盒。我们采用pCR®II-TOPO®体系。

      内含TOPO TACloning® reagents (Box 1) 和 One Shot® Chemically Competent cells (Box 2).

      TOPO 反应盐溶液:200 mM NaCl,10 mM MgCl2。

       

      实验步骤

       

      总体步骤:

      PCR 反应

      进行TOPO反应,连接PCR产物与TOPO载体

      用连接好的TOPO克隆转化TOPO感受态细胞

      蓝白斑筛选

       

      细节

      1、PCR 反应

      按正常步骤用Taq聚合酶进行PCR反应循环。

       

      2、进行TOPO反应,连接PCR产物与TOPO载体

      在反应体系中加入如下反应物:

      新鲜的PCR产物1ul

      TOPO反应盐溶液 1ul

      无菌水 4ul

      TOPO® vector 1ul

      共 6ul

      轻轻混合以上反应物,在室温(22oC-23oC)温育5分钟。

      将以上反应物置于冰上,进行转化

       

      3、用连接好的TOPO克隆转化TOPO感受态细胞

      向试剂盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入2ul以上反应液,轻轻混匀。在冰上进行转染10分钟。

      在42oC下热刺激细胞30秒,然后马上转移至冰上。

      向体系中加入250ul 室温下的SOC 培养液。

      水平离心转化管(200rpm, 37oC)1小时。

      用10~50ul 转化液向预热的培养基铺板。

       

      4、蓝白斑筛选

      取出10个白色或浅蓝色的菌落在含有50ug/ml卡那霉素或氨苄青霉素LB培养基中培养。

      提纯质粒,进行鉴定。

       

       

      其中的T载体可以用以下三种方法构建

      Ø 一种载体可以用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与MobII 酶切消解产生,3‘末端未配对的T。

      Ø 应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。

      Ø 应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。

       

          但是并非所有可用于PCR的耐热DNA聚合酶都具有非模版依赖的A添加能力。例如常用于高精度PCR反应的Pfu 聚合酶只能产生平末端,因而不能够用于TA克隆。

       

           目前,T载体可以从许多供应商那里购买得到克隆化的试剂盒,如pCR-Script[SK+](from Statagene 公司),PCRII的TA克隆试剂盒(from Invitrogen 公司),PGEM-T (from Promega 公司)等等。

       

          以下以PCRII的TA克隆试剂盒(from Invitrogen 公司)为例讲述TA cloning 的过程:

          从牛痘病毒(Vaccinia)中提取的DNA拓扑异构酶1可以识别5’-CCCTT序列,并连接5’-CCCTT和外源DNA(Shuman, 1991,1994),因而可用于TA cloning。

       

      参考文献

      1. Joseph Sambrook,David W Russell. Molecular cloning(3rd edition)

      2. Shuman, S. (1991).  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 

      3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19(5):1156

      4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19(5):1154.

      5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22(5):812-4. 

      6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19(16):4560. 

      7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20(8):324-5. 

      8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  

      9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.

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