TA克隆（TA-cloning）

     TA克隆（TA-cloning）是利用Taq聚合酶的特性将PCR产物克隆的方法，又称为T-载体克隆。

     Taq DNA聚合酶在四种dNTP存在下可以向非特性的PCR产物的3’末端特异性的添加一个A。这也成为Taq酶催化的PCR产物不能的连接至平末端载体的主要原因。相反地，如果此时有一个线性的带有粘性T末端的载体DNA（T载体），那么带有A粘性末端的PCR产物就可以的插入载体DNA中。这种方法被称为TA克隆。

 

实验材料：

Invitrogen公司提供的TOPO 快速TA 克隆试剂盒。我们采用pCR®II-TOPO®体系。

内含TOPO TACloning® reagents （Box 1） 和 One Shot® Chemically Competent cells （Box 2）.

TOPO 反应盐溶液：200 mM NaCl,10 mM MgCl2。

 

实验步骤：

 

总体步骤：

PCR 反应

进行TOPO反应，连接PCR产物与TOPO载体

用连接好的TOPO克隆转化TOPO感受态细胞

蓝白斑筛选

 

细节：

1、PCR 反应

按正常步骤用Taq聚合酶进行PCR反应循环。

 

2、进行TOPO反应，连接PCR产物与TOPO载体

在反应体系中加入如下反应物：

新鲜的PCR产物1ul

TOPO反应盐溶液 1ul

无菌水 4ul

TOPO® vector 1ul

共 6ul

轻轻混合以上反应物，在室温（22oC-23oC）温育5分钟。

将以上反应物置于冰上，进行转化

 

3、用连接好的TOPO克隆转化TOPO感受态细胞

向试剂盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入2ul以上反应液，轻轻混匀。在冰上进行转染10分钟。

在42oC下热刺激细胞30秒，然后马上转移至冰上。

向体系中加入250ul 室温下的SOC 培养液。

水平离心转化管（200rpm, 37oC）1小时。

用10~50ul 转化液向预热的培养基铺板。

 

4、蓝白斑筛选

取出10个白色或浅蓝色的菌落在含有50ug/ml卡那霉素或氨苄青霉素LB培养基中培养。

提纯质粒，进行鉴定。

 

 

其中的T载体可以用以下三种方法构建：

Ø 一种载体可以用限制性内切酶如XcmI, HphI, 与MobII 酶切消解产生，3‘末端未配对的T。

Ø 应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线形化载体的3’末端。

Ø 应用不依赖末端的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。

 

    但是并非所有可用于PCR的耐热DNA聚合酶都具有非模版依赖的A添加能力。例如常用于高精度PCR反应的Pfu 聚合酶只能产生平末端，因而不能够用于TA克隆。

 

     目前，T载体可以从许多供应商那里购买得到克隆化的试剂盒，如pCR-Script[SK+]（from Statagene 公司），PCRII的TA克隆试剂盒（from Invitrogen 公司），PGEM-T （from Promega 公司）等等。

 

    以下以PCRII的TA克隆试剂盒（from Invitrogen 公司）为例讲述TA cloning 的过程：

    从牛痘病毒（Vaccinia）中提取的DNA拓扑异构酶1可以识别5’-CCCTT序列，并连接5’-CCCTT和外源DNA（Shuman, 1991，1994），因而可用于TA cloning。

 

参考文献：

1. Joseph Sambrook，David W Russell. Molecular cloning（3rd edition）

2. Shuman, S. （1991）.  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 

3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1156

4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1154.

5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22（5）:812-4. 

6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19（16）:4560. 

7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20（8）:324-5. 

8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  

9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.