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浅谈质粒载体的构建及类型

  • 发布日期:2013-11-10      浏览次数:2665
    • 一、质粒载体必须具备的基本条件

         现行通用的基因克隆载体,绝大多数就是以质粒为基础改建而成的。一般说来,一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几个方面的条件:
      (1)具有复制起点

      (2)具有抗菌素抗生基因

      (3)具若干限制酶单一识别位点

      (4)具有较小的分子量和较高的拷贝数 

      二、质粒载体的选择记号

        在基因克隆中采用的质粒载体的选择记号,包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素E1的免疫性,以及抗菌素抗性等多种。但绝大多灵敏的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号。基因克隆实验中常用的几种抗菌素的作用方式及其抗性机理列于。

      三、不同类型的质粒载体

       (1)高拷贝数的质粒载体
        适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点,而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。因此,若在处于对数生长晚期的含有ColE1一类质粒的大肠杆菌培养物中,加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后,每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到1000~3000个之多。如果加入高浓度的尿核苷,质粒DNA又可进一步扩增2~3倍。


       (2)低拷贝数的质粒载体
        适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如,pLG338、pLG339及pHSG415。这类质粒载体的一个普遍性问题是,由于它们体积小、拷贝数低,与此相应的基因剂量也就较少,因此要制备大量的克隆DNA就很困难。


       (3)失控的质粒载体
        失控的质粒载体(runaway plasmid vectors):是一些低拷贝的质粒,其复制控制是温度敏感型的,也就是说在不同的温度下,拷贝数会有显著的变化。
        B.E.Uhlin等人(1979)首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。这种质粒载体在30℃下,每个寄主细胞中只含有适量的拷贝数,而当培养温度超过35℃时,质粒的复制便失去了控制,每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下,细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续2~3小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。zui后,细胞生长受到了抑制,并失去了存活的能力,但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。


       (4)插入失活型的质粒载体
        选用插入失活型质粒,将外源DNA段插入在会导致选择记号基因(如tetr、ampr、cmlr等)失活的位点,就有可能通过抗菌素抗性的筛选,大幅度地提高获得阳性克隆的几率。除了pDF471和Pdf42之外,都具有基因插入失活的克隆位点,因此都属于插入失活型的质粒载体。


       (5)正选择的质粒载体
        正选择质粒载体(direct selection vectors):这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子,便可大大降低需要筛选的转化子的数量,从而减轻了实验的工作量,提高了选择的敏感性。


       (6)表达型的质粒载体
        使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下,并能在大肠杆
      菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体(expression vectors)。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。                                  一种典型的大肠杆菌表达型质粒载体的主要组成部分,包括大肠杆菌的启动子及操纵全点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因

           那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒被成为天然质粒。在大肠杆菌中,常见的要用于基因克隆的天然质粒有ColE1RSF2124和pSC101等。
        鉴于天然质粒用作基因克隆载体存在着不同程度的局限性,所以科学工作者便在其基础上进行了修饰改造,首先发展出了一批低分子量、高拷贝、多选择记号的质粒载体

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