浅析质粒与载体

 

一、质粒的组成要素


a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
b 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+
c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因段
d P/E 启动子/增强子
e Terms 终止信号
f 加poly（A）信号 可以起到稳定mRNA作用


二、质粒图谱如何读取


*步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA段。一般来说，外源DNA段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。
c核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体
d 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的zui后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的zui后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
 


三、载体相关知识


1. 载体的概念
    载体主要有病毒和非病毒两大类,即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因段进入受体细胞的DNA


2. 载体的分类
按功能分成：

（1）克隆载体都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体）
（2）表达载体 具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。


按进入受体细胞类型分：

（1）原核载体 

（2）真核载体 

（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.

3. 基因工程载体的特点：
（一）都能独立自主的复制：载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。
（二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。
（三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。


4. 载体的选择和制备：
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意3点：
①选择合适的启动子及相应的受体菌；
②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（zui常用）做载体的4点要求：
①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。