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简述腺病毒包装

  • 发布日期:2013-11-20      浏览次数:3873
    • 腺病毒概述

          腺病毒(Adenovirus,AdV)是一种无包膜的线性双链DNA病毒,基因组长约35000 bp,理论上可编码22~40个基因,两端各有长约100~150bp的末端反向重复序列(ITR),在其左端ITR3,端为长约300bp的包装信号(Ψ)。病毒颗粒直径约80~110 nm,病毒衣壳有252个壳粒,呈规则的正二十面体面体结构,其中包括240个六联体和12个位于正二十面体顶部的五联体构成。

          腺病毒是一种非整合型双链DNA病毒,在自然界中广泛分布。尽管一些类型的腺病毒会引起人胃肠道、呼吸系统或眼部的急性感染,但是应用于基因治疗研究的腺病毒是安全的,对人无致病、致畸、致癌的潜在危害。

          利用基因工程手段将腺病毒基因组DNA改造成多种基因操作表达载体,目前常用的腺病毒包装系统有:AdMax系统和AdEasyTM系统。

       

      AdEasyTM包装系统 

          AdEasyTM 包装系统主要的特点是利用Cre/loxP系统在大肠杆菌(BJ5183)中完成外源基因插入腺病毒基因组的过程,获得环状的重组腺病毒基因组,并且具有在细菌中复制的必需元件。将重组腺病毒基因组酶切线性化后转染HEK293细胞,避免了双质粒共转染得到重组腺病毒。

      使用这个系统需要注意以下问题: 

      (1) 要用能表达Cre重组酶的特定的大肠杆菌,建议建立菌种库以免细菌发生变化;

      (2) 由于重组是在细菌中发生的,微小的基因组变化不易发现; 

      (3) 要获得高品质的重组腺病毒毒种(高病毒产量、高目的基因表达)应挑选多个重组腺病毒质粒,分别转染HEK293细胞,获得多个重组病毒来筛选。

       

      AdMax包装系统 

          AdMax包装系统是通过Cre/loxP 获得重组病毒,这个过程发生在HEK293细胞中,从而避免在细菌中重组。将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的包装质粒共转染HEK293细胞,利用Cre/loxP系统的作用实现重组,产生重组腺病毒。这个系统有多种优势,包括操作简便、重组效率高、获得的病毒产率高、目的基因的表达水平高(因为mCMV启动子比hCMV启动子强若干倍)等。 

          与AdEasy系统相比,AdMax系统有一定的优势:只需要3~4周就能完成从质粒构建到重组出毒,成功率大于98%(其中95%的克隆含有目的基因),因在真核细胞内重组出毒,保持了对腺病毒的生存压力,有助于重组腺病毒的基因组的完整性;而AdEasy系统的出毒成功率只有18~34%(Stratagene公司新版的AdEasy XL系统成功率在94%左右),且在细菌(BJ5183)中完成病毒基因组重组,理论上,失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变,病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

       

      腺病毒载体有下列优点:

      1、腺病毒的基因结构与功能研究的比较清楚;

      2、可装入基因的容量较大(8K);

      3、转染范围广,转染率较高,所有腺病毒载体均有转染分裂期和非分裂期细胞的能力;

      4、不整合到靶细胞基因组,无插入突变,无致癌性,对人无致病、致畸、致癌的潜在危害;

      5、可以复制出滴度高(可以达到1011 pfu/mL)、稳定性好、基因转移效率高的病毒;

      6、适用于在难以转染的细胞中进行的RNA干扰、过表达特定基因或过表达特定microRNA研究和In Vivo实验。 

       

      腺病毒包装

          重组腺病毒包装是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为架,在克隆,包装,扩增等各部条件做了改进和优化,达到了克隆阳性率更高,质量更可靠,包装稳定,出毒迅速,滴度高等效果。在此基础上,还拓展了更广泛的应用,可以提供各种带报告基因的,带不同标签的腺病毒构建和包装服务。 

          所包装的腺病毒已成功应用于信号转导,基因转位,Co-IP,干细胞研究等科研实验。并且可以完成较高难度的克隆构建,包括具有细胞毒性作用基因的腺病毒构建,在短时间内完成从原始质粒到病毒DNA的构建工作。

      服务简介:

      提供各种RNA干扰和基因过表达的腺病毒包装服务。

      服务内容:

          是以带荧光或不带荧光的pEC3.1(+)为穿梭载体,pAd/BL-Dest为骨架载体进行的过表达病毒包装;以pGensil为穿梭载体,pAd/BL-Dest为骨架载体进行干扰病毒的包装。

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