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慢病毒包装概述及步骤
发布时间:2013-11-19   点击次数:4161次

慢病毒包装概述

    目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。

    由于有些类型细胞脂质体转染效果差,转移到细胞内的 siRNA 半衰期短,体外合成 siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的,因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体,然后转移到细胞内转录 siRNA 的策略,不但使脂质体有效转染的细胞种类增加,而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ,在长期稳定表达载体的细胞中,甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的 siRNA 表达载体中,是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的,这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列,而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时,它指导的转录就会停止,在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。 U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子,其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游,适合于表达~ 21ntRNA 和~ 50ntRNA 茎环结构( stem loop )。在 siRNA 表达载体中,构成 siRNA 的正义与反义链,可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成 siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ~ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列,转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构,在细胞内进一步加工成 siRNA 。构建载体前通常要通过合成 siRNA 的方法,寻找的 siRNA ,然后从中挑选符合载体要求的序列,将其引入 siRNA 表达载体。

     慢病毒载体( Lentiviral vector )较逆转录病毒载体有更广的宿主范围,慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA 的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达 shRNA ,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,为在原代的人和动物细胞组织中快速而地研究基因功能,以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

     慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装 RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒,需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,离心取得上清液后,可以直接用于宿主细胞的感染,目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,从而高水平的表达效应分子。

 

慢病毒包装作用

1. 对于一些较难转染的细胞,如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率,而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加,这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

2. 进行稳转细胞株的筛选;

3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液;

在细胞相关的实验操作中,对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞,通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率,以达到目的基因的瞬时表达。

 

慢病毒包装步骤

     以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×106个293T细胞。


     1、取1.5ml灭菌EP管,加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀,室温孵育5min。


     2、取1.5ml灭菌EP管,取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。

     3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min

     4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。

     5、在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。

     6、将1ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育一晚。

     7、移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。

     8、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min,去除沉淀。

     9、病毒上清-80°C贮存。

     包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。

注意事项:

      1.在慢病毒感染细胞前,为检测病毒上清培养液内病毒的活性,并确定病毒与转染细胞之间的比率,需要确定病毒的滴度。病毒的滴度可以通过转染Hela细胞,然后使用抗体筛选稳定的细胞转染株,进行计数和数值统计。

      2. 在慢病毒转染细胞的过程中zui重要的一步是融合,只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞,因此,病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。

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