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浅析慢病毒载体
发布时间:2013-11-18   点击次数:2811次

慢病毒载体介绍

    慢病毒载体( Lentiviral vector, LVs )是在 HIV-1 病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能的将目的基因(或 RNAi )导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链 RNA ,其基因组进入细胞后,在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为 DNA ,形成 DNA 整合前复合体,进入细胞核后, DNA 整合到细胞基因组中。整合后的 DNA 转录 mRNA ,回到细胞浆中,表达目的蛋白;或产生 RNAi 干扰。

    慢病毒载体介导的基因表达或 RNAi 干扰作用持续且稳定,原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中,并随细胞基因组的分裂而分裂。另外,慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比,比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体,有鲜明的特色。大量文献研究表明,慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。

    慢病毒载体不表达任何 HIV-1 蛋白,免疫原性低,在注射部位无细胞免疫反应,体液免疫反应也较低,不影响病毒载体的第 2 次注射。

 

慢病毒载体的构建

1. 构建原理

   慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除 gag、pol 和 env 这 3 个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外,还包括 4 个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu 和 2 个调节基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是慢病毒中zui具特征性的病毒,*个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将 HIV 21 基因组中的顺式作用元件 ( 如包装信号、长末端重复序列 ) 和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由 HIV 21 基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的 HIV 21顺式作用序列。

    同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒 (RCV ) 的可能性,将包装成分的 5 ′ LTR 换成巨细胞病毒 (CMV ) 立即早期启动子,3 ′ LTR 换成 SV 40 polyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达 gag 和 pol、另一个表达 env 。根据这个原理,Naldini 和 Kafri 等构建了三质粒表达系统。

2. 三质粒表达系统

    三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在 CMV 启动子的控制下,表达 HIV 21 复制所需的全部反式激活蛋白,但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白 vpu;包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒 G 蛋白 (V SV 2G),应用 VSV 2G 包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围,而且增加了载体的稳定性,允许通过高速离心对载体进行浓缩,提高了滴度; 转移质粒中除含有包装、逆转录及整合所需的顺式序列,还保留 350 bp 的 gag 和 RRE,并在其中插入目的基因或标志基因 ( 绿色荧光蛋白 GFP) 。将载体系统分成三个质粒zui大的益处是使序列重叠的机会大大减少,减少载体重组过程中产生 RCV 的可能性。通过三质粒共转染 293T 细胞,超速离心后病毒滴度可达 109IU /m l 。

3. 四质粒表达系统

    为了减少 HIV 21 包装结构的序列同源性,进一步减少重组成 RCV 的可能性,Dull 等人将辅助基因去除。但由于 gag2pol 的转运需要 rev,因此,在上述的三质粒系统的基础上,构建成四质粒表达系统,该系统加上含 rev 的质粒减少了产生 RCV 的可能性,而且对非分裂期细胞转导效率无影响。

 

慢病毒载体应用

1. 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞;

2. 将目的基因 /RNAi 基因转入动物组织,以期获得长期表达;

3. 构建稳定表达目的蛋白 /RNAi 的细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内;

4. 基因治疗;

5. 转基因动物;

6. 基因敲除;

7. 药物研究:构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用;

8. 快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法。

 

    慢病毒( Lentivirus )载体是以 HIV-1 (人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。

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