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关于蛋白质提取与纯化
发布时间:2013-11-16   点击次数:1629次

一、 蛋白质的提取

    微生物生产的蛋白质或酶有来自胞内、来自细胞周质或被分泌到培养介质中。对胞外酶而言,当zui后产品是用于工业用途而不是需要太高纯度时,纯化工艺比较简单。许多酶是以更为复杂的胞内混合物的形式存在,这对蛋白质纯化研究人员提出更多的挑战。

    正常来说,大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

    (1)水溶液提取法:稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质zui常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。


A、pH值
    蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。


B、盐浓度
    稀浓度可促进蛋白质的溶解,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

 

   (2)有机溶剂提取法:一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内(度为10%,40度为6.6%)不会引起酶的变性失活。

 另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。

 

二、 蛋白质的分离纯化

亲和层析法: 

    亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中,特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合,产生复合物(E-S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是,前者进行反应时,配体(类似底物)是固相存在;后者进行反应时,底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M-L,或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此,当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了*个层析峰。

    然后,恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第M个层析峰(见图6-2)。显然,通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用。

一)原理

    亲和层析是一种吸附层析,抗原(或抗体)和相应的抗体(或抗原)发生特异性结合,而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原(或抗体)固相化后,就可以使存在液相中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上,借以与液相中的其他蛋白质分开,达到分离提纯的目的。亲和层析法(aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)
和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。

    此法具有、快速、简便等优点。

二)载体的基本要求和选择

理想的载体应具有下列基本条件:①不溶于水,但高度亲水;②惰性物质,非特异性吸附少;③具有相当量的化学基团可供活化;④理化性质稳定;⑤机械性能好,具有一定的颗粒形式以保持一定的流速;⑥通透性好,为多孔的网状结构,使大分子能自由通过;⑦能抵抗微生物和醇的作用。

    可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中,皂土、玻璃微球等吸附能力弱,且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的优良载体。

    琼脂糖凝胶的优点是亲水性强,理化性质稳定,不受细菌和酶的作用,具有疏松的网状结构,在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时,对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化,活化后性质稳定,能经受层析的各种条件,如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h-3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理,不引起性质改变,故易于再生和反复使用。

    琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose,含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松,而吸附容量比2B大,所以4B应用zui广。

三)试剂与配制

    1.Sepharose 4B

    2.CNBr

    3.抗原或抗体

    4.1Mol/L NaHCO3  取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

    5.0.1Mol/L NaHCO3

    6.2Mol/L NaOH

    7.0.01Mol/L pH7.4 PBS

       0.2Mol/L Na2HPO4   38.0ml

       0.2Mol/L Na2HPO4  162.0ml

       NaCl      32.76g

    加水至4 000ml。

    8.0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液  甘氨酸15.01g加水至1 000ml,取此液,加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

    9.7Mol/L尿素

    10.0.2Mol/L NaHCO3,(含0.1Mol/L NaCI)

       1Mol/L NaHCO3  100.00ml

              NaCl     2.93g

       加水至500.00ml。

四)实验方法

    1.琼脂糖活化

    ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干,加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤,立即转入100ml烧杯中,冰浴置于磁力搅拌器上。

    ⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰,加水20ml溶解,然后倒入琼脂糖中,小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右,反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0~11.0维持10min。

    ⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中,以冰水抽洗成中性,再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

2.偶联蛋白  20ml 4B液体相当于一半的固相载体。

⑴ 事先将需偶联的抗原(或抗体)蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。

⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中(在1.5min内,从抽洗到偶联),4℃缓慢搅拌一晚,使蛋白与活化的琼脂结合。

3.装柱

    ⑴ 选柱:不宜过大,一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。

    ⑵ 装柱:将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内,拧紧下口夹,让其下沉,数分钟后松开下口夹,使溶液约以1ml/min的速度流出。

    ⑶ 洗柱:以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3(含0.1Mol/L NaCl)洗涤至洗出液的OD280<0.02为止。

收集全部的洗脱液,测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量,由此可计算偶联率。

 4.吸附与解吸附

    ⑴按床体积1/10加样,浓度为1%~2%,缓慢加入待纯化的抗体(或抗原),用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱,流速为1ml/min,至洗出液OD280<0.02为止。

    ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸-HCl缓冲液,流速1ml/min,收集解吸附下来的成分,立即以1Mol/L NaHCO3中和,以免蛋白变性。

5.以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤,再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤,平衡后,可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。

6.结果判定

    ⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。

    ⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并,以生理盐水透析,然后浓缩或冻干保存。

       蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识,但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别,把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中,如盐析,有机溶剂提取,层析和结晶等;二是将混合物置于单一物相中,通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的,如电泳,超速离心,超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性,防止酸、硷、高温,剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。

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