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简述DNA甲基化检测
发布时间:2013-11-22   点击次数:2783次

    DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高度甲基化可引起抑癌基因表达沉默,细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生。目前,基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术,分为甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)和硫化测序PCR(Bisulfite sequencing PCR, BSP)。 

 

甲基化特异性的PCR(MSP)原理

     双链DNA变性解链后,在HSO3-作用下发生C→U转化,C若已有甲基化则无此改变;甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上,因此在HSO3-作用后,DNA CpG岛若无甲基化,则序列中的改变为C→U,CG→UG,若有甲基化则为C→U,CG→CG,用不同的引物做PCR,即可检测出这种差异,从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说,DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较,变化为C→T,CG→CG,相应其互补链的改变为G→A,CG→CG。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,zui后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高,应用范围广。

 

硫化测序PCR(BSP)原理:

    结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

 

甲基化服务流程

1)   根据目的基因启动子序列设计相应引物;
2)   基因组DNA的提取和定量;
3)   亚硫酸氢钠修饰基因组DNA;
4)   修饰后DNA纯化回收;
5)   a、结合实时定量PCR的qMSP;
        b、BSP,对PCR产物进行测序并与未经处理的序列比较;
6)   数据处理;
7)   向客户提交数据分析结果与实验报告。

 

样品要求:

    尽可能新鲜和足量的组织(≥50mg)、细胞样品(≥106)或全血(≥300μl),或直接提供纯化好的DNA(≥5μg/样品)。

 

基因甲基化检测

    甲基化是在DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基,在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.

    DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式,它不改变DNA的一级结构,却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。

    CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象,而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。

    因此,基因启动子甲基化检测在临床诊断(如甲基化检测与低剂量CT相结合)、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

    目前甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR,MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法.MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增,zui后通过琼脂糖凝胶电泳分析,确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。

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