简述DNA甲基化检测

    DNA甲基化是哺乳类动物一个重要的基因外遗传信号。有研究表明,DNA甲基化与大多数肿瘤的发生相关,抑癌基因启动子CpG岛的高度甲基化可引起抑癌基因表达沉默，细胞出现无节制生长,导致肿瘤的发生。目前，基因的甲基化研究主要结合亚硫酸氢钠处理和PCR技术，分为甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化测序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。 

 

甲基化特异性的PCR（MSP）原理：

     双链DNA变性解链后，在HSO3-作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO3-作用后，DNA CpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应（PCR）扩增，zui后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。

 

硫化测序PCR（BSP）原理：

    结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

 

甲基化服务流程：

1）   根据目的基因启动子序列设计相应引物；
2）   基因组DNA的提取和定量；
3）   亚硫酸氢钠修饰基因组DNA；
4）   修饰后DNA纯化回收；
5）   a、结合实时定量PCR的qMSP；
        b、BSP，对PCR产物进行测序并与未经处理的序列比较；
6）   数据处理；
7）   向客户提交数据分析结果与实验报告。

 

样品要求：

    尽可能新鲜和足量的组织（≥50mg）、细胞样品（≥106）或全血（≥300μl），或直接提供纯化好的DNA（≥5μg/样品）。

 

基因甲基化检测

    甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程.

    DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因的表达、及基因组的稳定性中起着重要的作用。

    CpG岛的高甲基化是肿瘤中存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。

    因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断（如甲基化检测与低剂量CT相结合）、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

    目前甲基化特异性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应（PCR）扩增，zui后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。