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siRNA干扰载体构建与引物设计
发布时间:2014-08-08   点击次数:1646次

 

siRNA干扰载体构建与引物设计

 

siRNA干扰载体构建过程中针对siRNA设计的引物是怎么设计的?

一般是合成一对引物,然后退火,再与线性化的载体做连接。由于引物比较长,所以合成时一般都会有比较多的碱基突变,因此,做shRNA表达载体构建的主要难度,在于筛选出正确的克隆,有时候可能要选很多个克隆测序才能筛到想要的。具体的序列组成,一般是sense-loop-antisense。不同的公司会有不同的设计原则的。

经验:我们一般不去考虑构建载体来得到siRNA!
载体表达siRNA方法主要存在以下缺点:
1、外源导入shRNA的表达会干扰细胞本身miRNA的正常表达,而miRNA在基因的表达调控方面有着至关重要的作用,目前已经证实很多疾病的产生通miRNA的表达异常存在确切关系,已有很多文献报道和证实;
2、载体构建的周期长,操作较为复杂,试验重复性不好,做过的人应该大多都知道;
3、载体用于体内试验的毒性非常大,容易激发机体强烈的免疫应答反应,副作用大,已有多篇文献证实;
4、通量低,影响因素更多,体内试验的效果很差,存在安全性的问题;
5、shRNA的表达在时间和表达量上都较难控制等。
这也是为什么现在10多种进入临床试验的RNAi药物几乎都是用化学合成的siRNA来做的原因!

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