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第九章 蛋白显色
发布时间:2015-07-14   点击次数:1804次

                                                      第九章 蛋白显色


    酶促反应比同位素安全且快速,已经成为 Western Blot 的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法:化学发光和底物显色,前者灵敏度很高,已经达到皮克级别,甚至还有飞克级别的,灵敏度超过了同位素;而后者由于直接显色而操作简便且成本低。

    大家zui为熟悉熟悉当数辣根过氧化物酶 HRPHorseradish Peroxidase)和碱性磷酸酶 APAlkalinePhosphatase),此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase)和 β 半乳糖苷酶(β-Galactosidase)。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物 5--4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物;而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物,将 3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将 4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法,辣根过氧化物酶在H2O2存在下,氧化化学发光物质鲁米诺(luminol,氨基苯二酰一肼)并发光,在化学增强剂存在下光强度可以增大 1000 倍,通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。

 HRP 标记二抗用 DAB 显色,按顺序依次将 DAB 三种剂各取 3 滴于 5 ml 蒸馏水中,避光混匀,将膜加入显色液中避光显色 5-15min 终止反应,对照 Marker 记录实验结果,将 NC 膜晾干扫描保存。HRP的生色底物显色有 DAB4-CNCN/DABAEC  TMB 等。

               

     HRP 化学发光反应底物主要有 LuminolECL  SuperSignal 系列。可直接从公司购买试剂盒,操作比较简单,原理如下(二抗用 HRP 标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到 HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

                           

 AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色,成像性好容易拍照。 AP的底物显然更稳定,不像HRP那样需要新鲜 配制  H2O2  的不稳 定成 分,作 为试 剂盒可 以保 存时间 更长 。常用显 色底物 的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3  -Indolyphosphate p-Toluidine Salt)  NBT (Nitro-Blue TetrazoliumChloride)INT

 底物发光法:将两种显色底物 1:1 等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀,用玻璃胶片把膜包起来,马上在暗室中将 X 光片覆盖在膜的上面(时间根据光的亮度来衡量),显影、定影。(注意:发光法检测的时候曝光时间要恰到好处,过短会导致曝光不彻底,影响条带亮度,过长会导致荧光信号衰弱,也会使背景颜色加深)除了酶连二抗作为指示剂,也可以使用其它指示剂,比如:荧光素异硫氰酸盐标记的二抗(可通过紫外灯产生荧光);生物素结合的二抗等等。

关于磷酸化蛋白检测的注意事项:

 保持待测蛋白处于磷酸化状态,在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂(NaF,可以防止去磷酸化),并将标本时刻保持在冰浴中。

 使用 5% BSA 作为封闭试剂,不能使用脱脂奶粉(因为脱脂奶粉中含有酪蛋白,会出现很高的背景)。

 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的,当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分!确保使用阳性对照。


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