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第八章 抗体孵育
发布时间:2015-07-14   点击次数:1233次

                                   第八章 抗体孵育


一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗的说明书,按照适当比例用封闭液稀释一抗。吸尽封闭液后,立即加入稀释好的一抗,室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育 12 小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以在 4℃缓慢摇动孵育一夜。(注意:抗体浓度过高会导致背景较深,过低会导致和抗原结合不充分,出现假阴性 )。回收一抗。然后加入 Western 洗涤液,在摇床上缓慢摇动洗涤 5-10 分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤 5-10 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

参考二抗的说明书,按照适当比例用封闭液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。吸尽洗涤液后,立即加入稀释好的二抗,室温或 4℃在摇床上缓慢摇动孵育 12 小时。回收二抗。然后加入 Western 洗涤液,在摇床上缓慢摇动洗涤 5-10 分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤 5-10 分钟。共洗涤 3 次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 2 步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合,洗涤的效果直接影响结果背景的深浅,所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合,减少背景。同时短时间多次的洗膜(如 5-6 次,每次 3 分钟)比长时间少次数的洗膜更有效。 3  TBS 洗涤是为了洗去膜上的 Tween-20,因为它可以阻碍底物的沉积。

  注意事项

1. 抗体保存注意事项:

收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装和保存!

对于大部分抗体,比较合适的保存方式是分装后保存在-20 

分装的量以一次实验用完为好,zui少不能少于 10 ul 每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在 40℃,避免再冻起来!

避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。

大部分抗体收到后 40℃短暂保存 1-2 周对抗体活性是没有影响的。长期保存,加入叠氮纳,防止细菌污染。

2. 一抗/二抗使用问题:

   一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择zui适当的比例,一抗二抗的选择直接影响实验结果以及背景的深浅。要严格保证反应时间,洗膜要注意尽可能地将一抗二抗洗净,有利于降低背景;还要注意一抗二抗的匹配。

3. 天然和非还原样品问题:

   有些抗体只能识别的表位是非连续氨基酸,这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续,但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就只能识别靶蛋白的空间结构状态(抗体说明书中会有特殊说明)。对于这些样品,缓冲液和凝胶中就不能含有 SDS,并且不能够对蛋白进行加热变性。有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态,对此类样品,就需要将缓冲液和凝胶中的还原剂 DTT beta-巯基乙醇去除。

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