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第七章 封闭(Blocking)
发布时间:2015-07-14   点击次数:1178次

   第七章 封闭(Blocking)

   杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点,为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景,一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位,也不与抗体或检测试剂有交叉反应。zui常见的封闭剂是 BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 Tween-200.05 - 0.1%)稀溶液 PBST 或者 TBST

5%脱脂奶粉或 BSA(室温孵育 1 h

Western Blot 膜封闭液

Tween-20 的作用:Tween-20 是一种非离子型去污剂,有复性抗原的作用,可提高特异性的识别能力。在做 westen blot 时,用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。Tween 这种非离子型去污剂在乳化蛋白时,不破坏蛋白的结构,可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。离子型去污剂如 SDS 则破坏蛋白的结构。

封闭剂选择的特殊情况:

脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化。检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。

一般封闭条件为:

    室温或者 37℃缓慢摇荡 12 h,特殊情况也可 4℃封闭一夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景,而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

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