第六章 蛋白转膜

                                第六章 蛋白转膜

6.1  转膜的定义

将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如 NC 膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理*相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

6.2  转移膜的选择

    杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于 Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC） 和PVDF 膜。NC 膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的 NC 膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 两种规格的 NC 膜。大于 20 kD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜，小于 20 kD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜了，如用 0.45 μm 的膜就会发生“Blowthrough"的现象。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但 PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。

zui 常 用 于 Western Blot 的转移膜主要是 硝 酸 纤 维 素 （ Nitrocellulose, NC ）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和 NC 膜的特点相似,主要用于核酸杂交。

    硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜：NC 与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；非特异性本底显色浅；价格低廉，使用方便。但结合在 NC 上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失； NC韧性较差，易损坏。

    聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。

膜的选择主要根据：

膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；

不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；

如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。



                                                      

6.3  转膜步骤（以槽式湿转为例）

1.  将胶浸于转移缓冲液中平衡 10 min。

注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。

2.  依据胶的大小剪取膜和滤纸 6 片，放入转移缓冲液中平衡 10 min。如用 PVDF 膜需用纯甲醇浸泡饱和 3-5秒钟。

3.  装配转移三明治：海绵/3 层滤纸/胶/膜/3 层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。

    切记：胶放于负极面（黑色面）。

4.  将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100 V，1 h（电流约为 0.3 A）。

注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。


 5.  转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

                                                                        

6.4  转膜注意事项

1. 泡膜：转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移 buffer 浸泡 20min；

a. 凝胶若是没在预冷的转膜 buffer 中浸泡，就会在转膜过程中出现凝胶皱缩，导致出现转移条带变形。

b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

2. 转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板；

3. 转膜条件：0.35 A/250 V/1 h/40 min/冰浴中进行转膜（转膜过程产生大量的热，注意冷却）；

（具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，反之则短。）

4. 其它注意事项：

a. 避免直接用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

b. 夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不*。

c. 保证膜和滤纸的大小和凝胶*一样，过大和过小都会影响转膜效率。

                      d. 鸡来源的抗体与 PVDF 和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体

6.5  转膜后检测（此步可以省略）

   转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的 TBST（或 PBST）中漂洗 1-2 分钟，以洗去膜上的转膜液。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量zui大的 1-2 条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液或硬度墨汁染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的 SDS-PAGE 胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

a. 丽春红染色：蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。

b. 印度墨汁染色：只用于放射性标记抗体或放射性标记 A 蛋白探针的 Western 印迹过程。

印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。这时，可改用其他检测方法或换用丽春红 S。

注意：从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。