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第五章 蛋白电泳
发布时间:2015-07-14   点击次数:935次

                                     第五章 蛋白电泳


5.1  SDS-PAGE 基本原理

1. SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品处理液,SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

2.  强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇,DTT)可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。

3.  蛋白质分子结合 SDS 阴离子后,所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷,从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量,而与其所带电荷的性质无关。

5.2  PAGE:聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide,简称 Bis)在催化剂(过硫酸胺或核黄 AP)和加速剂(四甲基乙二胺 TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强,具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化,使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化(AP-TEMED)和光化学催化(核黄素-TMTED体系。

                                      

5.3 聚丙烯酰胺凝胶分类

   PAGE 分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

                                         

不连续系统的浓缩效应:

凝胶层的不连续性:浓缩胶的孔径大,分离胶的孔径小。在电场的作用下,蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小,移动快。而在小孔胶中遇到的阻力大,移动慢。因此,在两层凝胶的交界处,由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。缓冲液离子成分和pH的不连续性:HCl易解离出Cl-,它在电场中迁移率大,走在zui前面,故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH6.8 的缓冲液中解离度很小,仅为 0.1-1%,因而在电场中迁移率很小,称为慢离子或尾随离子。蛋白质均带负电荷,在电场中均移向正极,其有效迁移率介于快慢离 子之间,于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处,被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.8的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质,因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大,被留在后面,然后分离成多个区带。


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