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TA克隆专业化的艺术
发布时间:2014-09-22   点击次数:695次
   TA克隆技术(TA cloning)利用Taq聚合酶具有末端转移酶(TdT)活性,但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点,可在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。pMD18-T是一种克隆PCR产物的专用载体,它是由pUC18载体在Xba I和Sal I识别位点间插入一个EcoR V位点,然后用EcoR V进行酶切使质粒线性化,并在它的3'端添加“T”构建而成。因其3'端带有一个突出的“T”尾,能地与带“A”尾的PCR产物连接,极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物zui简便、快捷的方法。
 
  1.TA克隆技术只需4个步骤:①扩增目的PCR产物;②制备T克隆载体;③基因合成产物直接克隆至T载体上④转化并筛选重组子。 PCR2.转化后无克隆菌产生转化过程有问题或感受态细胞失活,可通过转化pUC18/19等未切割的可用于抗性筛选的质粒,基因合成3.插入对照DN段的阳性率低TA克隆10×快速连接缓冲液稀释不当提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度,10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液连接反应存在问题连接缓冲液只有低的活性。10×快速连接缓冲液含有ATP,温度波动ATP 易降解。使用一次性分装的缓冲液,避免其反复冻化定点突变通过凝胶比较连接的和未连接的DN段并检查分子量标准DN段是否被连接成高分子量的片段,用大约20ng DNA 分子量标准(如Lambda DNA/Hind III 分子量标准)TA克隆建立一个连接反应以检测连接酶及缓冲液的活力T 突出端丢失,引起载体平端连接,因而蓝色菌落数高于白色菌落数避免核酸外切酶的引入,降解T 突出端。只使用无外源核酸酶的T4 连接酶,多肽合成采用插入对照DN段,连接转化时白色克隆菌数低于60%。 10×快速连接缓冲液稀释不当提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度,10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液T 突出端丢失,TA克隆引起载体平端连接,因而蓝色菌落数高于白色菌落数。避免核酸外切酶的引入,降解T 突出端。只使用系统自己提供的T4 连接酶,这种连接酶外切酶活力zui低连接温度太高连接温度过高(>28℃)可使背景增加,使重组克隆菌减少。降低连接温度可以提高白斑率PCR 片段很多没有A 尾。将PCR 产物纯化后进行加尾反应。样品纯化后进行连接反应插入片段:载体比例不理想。凝胶电泳检测PCR 产物的完整性及产量,优化插入片段多个PCR 产物被克隆进pGM-T 或pBS-T 载体凝胶纯化目的PCR 产物PCR 产物连接时白色菌落数很少或根本没有。
 
  TA克隆 10×快速连接缓冲液稀释不当提供的T4 连接酶缓冲液为十倍浓度,10μl 反应体积加1μl T4 连接酶缓冲液连接孵育时间不够长连接过夜可得到理想结果PCR 产物中含有抑制连接的成分,导致连接的失败将PCR 产物和连接反应对照混合,观察是否存在抑制效应。如怀疑TA克隆有抑制成分存在,应重新纯化PCR 产物PCR 产物没有3’-A 突出端,不能连接。并非所有DNA 聚合酶都产生3’-A 突出端,如Pfu酶的PCR产物为平端。平端PCR产物可先通过聚合酶及dATP 进行加尾反应产生3’-A 突出端,再与T载体连接,gene synthesis由于紫外灯过度照射形成嘧啶二聚体,PCR 产物不能连接。PCR 产物已经插入,但未破坏lacZ 基因的翻译框。插入片段:载体连接比例不理想TA克隆DNA 重排检测大量克隆观察重排是否是随机的。如果是随机重排,通过筛选可得到有目的DN片段的克隆菌,而如果所有克隆是一种重排方式,则需要使用修补缺陷的菌株保护插入片段,减少重排事件的发生PCR 连接反应只产生白色克隆(没有蓝色克隆)氨苄失活,因而氨苄敏感菌可生长。检查氨苄平板是正常制备并在一个月内使用菌株(如*0)丧失F’因子检测背景对照,如果菌落不是蓝色的,则可能是宿主菌细胞丢失F’因子(假设acIqZ.M15 位于宿主菌的F’因子上,并使用正常平板)。TA克隆用于T-载体系统的感受态细胞一定要正确制备平板不适合蓝白斑筛选。检测背景对照,如果克隆菌不是蓝色的,检查平板是否含有氨苄/IPTG/X-Gal 以及是否新鲜。如平板有问题,重新制备新鲜平板含有目的PCR产物的克隆菌.
 
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