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miRNA定量检测如何达到Z佳效果
发布时间:2014-11-25   点击次数:1038次
   miRNA定量检测在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时,其可以形成微小的(平均大小约100-400nm)单层脂质体。这些脂质体带正电,可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此miRNA定量检测使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称,miRNA定量检测一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
 
  对于miRNA定量检测,可以采用 RT-PCR,实时定量PCR,和Northern Blot等方法进行检测,通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。值得注意的是在进行实时定量PCR时,cDNA合成要用oligo(dT)【oligo(dT),一种引物,cDNA合成zui常用的引物是与真核细胞miRNA定量检测分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)】,而不是随机引物,且预扩增片段位于靶miRNA定量检测序列中siRNA位点的上游,由于功能的执行者是蛋白,因此还需要对蛋白水平进行检测,可通过Western Blot、荧光免疫检验法、流式细胞分析术、ELISA和表型分析等方法来检测干扰效果。然而miRNA定量检测zui大以及zui终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。
 
  miRNA定量检测一般在转染后24小时内发生,其引发基因沉默的程度和持续时间依赖于靶蛋白质的降解率(turnover rate of the protein) 以及siRNA在细胞内的寿命以及其逐渐被稀释的程度。由于miRNA定量检测是进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制,因此如何地将定量检测转入细胞也是成功抑制基因表达的关键步骤。例如,一个siRNA分子对某特定基因的抑制效率为90%,而转染效率为10%,那么zui后抑制蛋白表达zui后的效率只有9%,可见如何提高miRNA定量检测的转染效率非常重要。
 
  1、对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列:为了找到潜在靶位点,扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析,去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能,siRNA应根据miRNA定量检测低二级结构的区域设计。
 
  2、选择低GC含量的siRNA:GC含量在40~55%的siRNA比GC含量在55%以上的siRNA活性高。
 
  3、miRNA定量检测纯化体外转录siRNA,在转染前要确认siRNA的大小和纯度:为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱(Ambion siRNA体外合成试剂盒中已包括纯化柱保证siRNA纯度)或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注意:化学合成的miRNA定量检测通常需要跑胶电泳纯化【即聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)胶纯化】。
 
  通过体外转录的方法可以合成miRNA,这样的成本相对化学合成法而言比较低,是一种性价比高的筛选miRNA定量检测的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到miRNA。以Silencer siRNA Construction Kit为例,一旦得到DNA Oligo模版(这个还是需要DNA合成的,不过DNA合成的成本就比较低了),只要24小时就可以,不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的miRNA定量检测,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间。毕竟,化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是miRNA定量检测通过体外转录得到的miRNA只要较低的浓度就可以达到化学合成较高浓度得到的效果。
 
  

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