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RNAi干扰检测核心要点概要
发布时间:2014-11-25   点击次数:939次
   RNAi干扰检测是一个十分重要的环节。不管是设备还是环境都是要的合格,在进行干扰检测之前应该考虑靶基因产物的半衰期及其在细胞中的丰度和表达调控机制。由于RNAi干扰检测是通过降解靶基因RNA而达到一直基因表达的目的,因此它不使用于研究那些具有长半衰期的蛋白质在细胞中的功能,RNAi干扰检测不能像基因敲除(gene knockout)一样在特定的细胞中确实靶基因,它只能较大限度的抑制靶基因的表达,其抑制效率zui高可达95%以上,因此这种方法又被称为基因敲减(gene knockdown)。据此,RNAi干扰检测不适用于有些酶基因功能的研究,因为有时候微量的酶分子就可以在细胞中行使功能,酶基因表达的抑制并不能从表型上检测到明显的变化。
 
  为了使RNAi干扰检测达到理想效果,我们必须注意以下事项:
 
  不同细胞的转染效率不同,一次对于不同的转染试剂和培养细胞需要通过预试验来确定转染的条件,对一种细胞行之有效的方法并不一定适用于另一种细胞。正常情况下生长状况良好的细胞转染效率比生长状况较差的细胞要高。RNAi干扰检测尽量采用传代次数较少的细胞,因为转染效率随着传代次数的增加而逐渐下降,一般采用传代次数在50代以内的细胞进行转染。对细胞的转染效率影响比较大的另一种因素是细胞的生长密度,RNAi干扰检测对贴壁的细胞来说,zui佳转染密度为30%~70%,太低或太高都会导致转染效率的下降。
 
  如果一个siRNA分子在细胞中不能抑制靶基因的表达,首先应该查明RNAi干扰检测所采用的基因序列和试验用的细胞系是否来源于同一物种,然后检查所采用的基因序列是否是可靠的,因为它可能存在序列错误、突变(在肿瘤细胞中)或核苷酸多态性。
 
  RNAi干扰检测抑制靶基因的表达以后,先观察细胞表型的变化,如细胞生长状况与形状的变化。然后通过免疫印记与免疫荧光检测细胞内蛋白质水平的变化。如果没有特异性的靶蛋白抗体,RNAi干扰检测可以通过Northern印记确定其mRNA变化。
 
  必须采取措施防止并消除可能的Rnase污染。因为极少量的Rnase就可以破坏整个RNAi干扰检测试验,而RNAase遍布整个实验室,用适当的阳性siRNA对照优化转染和检测条件。对于大多数细胞来说看家基因是zui合适的阳性对照,用不同浓度的看家基因siRNA转染细胞,RNAi干扰检测48小时后检测看家基因蛋白质或mRNA水平,以确定靶siRNA转染的zui佳条件,试验中应包含1~2个阴性对照以确定siRNA分子对靶基因的抑制作用的特异性。
 
  RNAi干扰检测用于转染的siRNA分子的浓度同靶基因的特性和细胞类型相关。浓度太高会导致细胞毒性,浓度太低则不易检测到靶基因表达水平的变化一次用于转染细胞的siRNA分子浓度一般在30~100nmol/L之间,体外合成的siRNA分子对靶基因的抑制作用是瞬时的,RNAi干扰检测细胞中受到抑制的靶蛋白一般在转染5~7天之后,即经过7~10个细胞增殖周期之后就可以逐渐恢复至正常水平。
 
  上海基屹生物科技有限公司在操作RNAi干扰检测这一方面有很好的经验,欢迎广大新老客户,欢迎洽谈!
 
  

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