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TA克隆对基因技术的新进展
发布时间:2014-11-24   点击次数:926次
   TA克隆是一种以表达为基础的基因分离技术。它直接用基因组DNA如酵母人工染色体(YACs)捕捉克隆片段,从而达到快速地从大的基因组区域分离表达序列。其主要技术是用PCR扩增来自不同组织的混合TA克隆池或已克隆的克隆文库,扩增的克隆片段与用生物素随机标记的基因组目标DNA杂交,捕获亲和素标记磁珠上的与目标DNA杂交的克隆片段,然后洗脱磁钵上捕获的TA克隆并进行PCR扩增,再进行第二轮筛选,并将筛选出的克隆片段克隆到载体上。
 
  TA克隆产物克隆方法的新进展,随着克隆技术的发展和普及,克隆克隆产物已经广泛的应用于分子生物学的各个领域。通常克隆产物不具有粘端,只能进行平端连接的克隆,且由于TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,致使平端连接的效率不高,克隆效率低。改进的方法一股是在TA克隆引物的5'端加上限制性内切酶识别序列,或是改变引物中l至数个核昔酸引入限制酶位点,然后用相应的酶处理克隆产物即可获得粘端,通过粘端的连接,可平端连接通常情况下,TA克隆产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使基因合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将TA克隆产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆克隆产物。引物决定克隆扩增产物的特异性与长度。因此,引物设计决定PCR反应的成败。
 
  TA克隆主要是对基因的染色体上具有一定座位的遗传单位,是DNA分子中一定长度的核苷酸序列。植物的生长发育是在多种代谢和生理过程基础上所发生的基因在时空上表达的综合现象,开发和分离潜在的各种有价值的基因并深入研究其表达机理,对作物品种的改良具有重要意义。因此TA克隆对植物基因的克隆并发展与之相关的技术已引起人们的日益关注和投入,近年来其研究方法不断改进,新技术不断涌现,这为进一步研究诸如各种调节植物生长发育的基因、逆境与防御反应的基因、植物细胞凋亡的基因等提供了新的途径。
 
  TA克隆的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。TA克隆产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在TA克隆检测到与某一表型相关的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主要操作程序为:(1)TA克隆产物的提取、克隆及序列测定。首先将克隆检测到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引物长度多在20 nt以上;退火温度在60℃以上;(2)将基因组DNA做适当酶切,然后在其两端连接上相同的接头根据接头的序列扩增。
 
  

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