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miRNA定量检测的独具匠心
发布时间:2014-11-24   点击次数:1049次
   所谓miRNA定量检测就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆,其目的在于对目的DNA进行进一步分析,或者进行重组改造等。miRNA定量检测的基本过程包括:(1)目的DNA片段和载体的制备;(2)目的DNA片段和载体的连接;(3)连接产物的转化;(4)重组子筛选。
  选择适宜的限制性核酸内切酶,消化已知目的DNA和载体,获得线性DNA,用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况,选择一种或者两种适当的限制酶切割,分别产生对称性粘性末端(用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端)、不对称粘性末端(用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端)、平端。在miRNA定量检测时,不对称相容末端连接,次选对称性粘性相容性末端连接,由于平末端连接效率较低,通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ,一般先将不匹配末端补平,然后再以平末端连接。
  miRNA定量检测实验注意事项
  (一)定量检测实验对照设置
  为使miRNA定量检测实验成功,并能在未获得目的克隆时,查明实验失败的原因,每次实验应包括相应的对照。其中包括感受态细胞的转化效率、抗菌素是否有效、连接的效率、未连接质粒的背景、磷酸酶处理的效果等。
  (二)miRNA定量检测检测连接反应的效果的对照实验
  为检测连接反应的效果,线化(单限制性酶切,非磷酸酶处理)质粒需同实验样品平行连接。取一部份连接反应液用于转化,随后涂布到选择培养基上。平板上所生长的菌落数,可同相同量、未连接的线化质粒、转化相同数目的细菌后,涂布在选择培养基上所生长的菌落数比较。如果连接成功,自连接质粒在平板上的菌落数,miRNA定量检测会远远高于未连接的线化质粒转化细菌所得的菌落数。如果线化成功,未连接的线化质粒(未连接的质粒背景)所得的菌落数应很低。如miRNA定量检测连接效率高,则自连质粒所得的菌落数应同用完整质粒转化细菌所得的菌落数相近。 另一种非定量的方法是将等量的未连接质粒和连接质粒在琼脂上电泳,连接后的样品的迁移率会降低。
  (三)miRNA定量检测连接实验需要优化的实验指标
  1、载体和插入片段的摩尔浓度比特别重要,载体:插入片段的摩尔数的变化范围可为8:1到1:16,但通常的变化范围是3:1到1:3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验,来选择zui佳的载体和插入片段的摩尔数比。在zui小的反应体积中,通常一个连接反应用10~50 ng的载体DNA。
  2、进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言,平末端连接在22℃保温4~16小时,粘性末端在22℃保温3小时,或4℃保温16小时。大多数连接反应用miRNA定量检测连接酶,但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接,平末端连接时用此酶,活力较低。每次连接反应用1~10 Weiss单位的高质量连接酶。
  3、用于转化连接反应液的细菌菌株,以及用于重组质粒扩增的菌株,需经挑选,细菌生长的温度也要挑选。当用pGEM载体克隆大片段时(>7~8 kb),经转化的菌株在30℃而不是在37℃生长,更有利于连接。作简单的miRNA定量检测连接实验,定量检测转化效率的感受态细胞就可满足克隆需要,更高转化效率的感受态细胞可用于作比较困难的克隆实验。为提高获得目的克隆的机会,应用尽可能高转化效率的感受态细胞(>108克隆/ugDNA)。 筛选重组克隆时,需选择抗菌素的浓度。
  不同厂家生产的miRNA定量检测连接酶反应条件稍有不同,但其产品说明书上均有zui适反应条件,包括对不同末端性质DNA分子连接的miRNA定量检测连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液(10×、5×、2×),其中多已含有要求浓度的ATP,应避免高温放置和反复冻融使其分解。目的DNA片段制备、回收、纯化时,应避免外来DNA污染。连接产物的转化:miRNA定量检测细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力,因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞,当细菌大量增殖的同时,导入的重组DNA也得到增殖。miRNA定量检测态细胞所用离心管、培养瓶经酸碱处理或使用新的,15 lbf/in2高压灭菌20min。白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定。
 

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