荧光定量PCR检测故障导航标

 　　荧光定量PCR检测的基本原理就是在PCR扩增过程中，随着PCR循环数的递增，PCR产物不断积累，荧光信号也会相应的增加，这样就可以通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测。实现基因的相对定量、定量和定性分析。荧光定量PCR检测系统采用热电制冷器实现金属模块变温，即通过微机自动控制电路去控制热电制冷器正反向工作，改变变温金属模块的温度，荧光定量PCR检测使置于金属模块里的试管中的反应物达到PCR的要求。参照图1，热循环单元包括可插放若干个试管的变温金属模块，热电制冷器，散热器，风扇，热盖。风扇、散热器和热电制冷器依次从两边紧贴变温金属模块，由于热电制冷器采用两面紧贴的结构，因此荧光定量PCR检测与普通将热电制冷器贴在模块底部的结构比较，单位面积的加热或制冷功率更大，温度变化的速度也更高，试管的上方设有防止试管内反应物蒸发的热盖。在变温金属模块和热盖中分别设有温度传感器，传感器将温度信号输给控制单元。
　　该荧光定量PCR检测的主要优点：
　　1、背景干净：自主知识产权的不形成二聚体的引物设计使PCR反应背景干净。
　　2、灵敏度高：由于采用荧光染料(SYBR Green I )，灵敏度高荧光探针PCR一个数量级。
　　3、操作简便：荧光定量PCR检测逆转录(RT)-实时荧光扩增(PCR)两步合并单管反应。
　　4、特异性高：由于选取引物序列具有代表性，经过多次的实验，特异性高。
　　5、价格便宜：由于采用荧光染料，价格比TaqMan探针方法低。
　　荧光定量PCR检测常见故障维修：
　　故障1机器程序运行中出现“PCR．EXE程序出错”，点击后程序关闭，检测结果丢失。
　　造成这种故障的原因是232接口不良，荧光定量PCR检测系统在通讯时对232接口的读写出现错误，就会出现以上报警。将232接口固定紧或重新焊接即可解决。
　　故障2 无试管状态下各孔的荧光值差异增大。这种现象是因为试管孔或热盖被污染，这时需要清除试管孔或热盖上的污物。清除污物时用毛刷沾少量*清洗模块上的锥孔及热盖，保证荧光定量PCR检测试管与锥孔壁接触充分、导热良好、避免污染。表面如有污迹，还可用软布沾清洁膏清洗。注意在仪器进行清洗时，必须切断电源，清洗模块上的锥孔时严禁将清洗剂滴入孔内。
　　故障3个别荧光曲线突然(较大)下降。造成这种故障的原因主要是试管内留有气泡，由于温度升高后可能会造成气泡破裂，荧光定量PCR检测使荧光值突变(降低)，因此处理样本时要注意离心、振荡均匀，把离心管放置仪器内时要检查试管内是否有气泡。
　　故障4模块降温速度明显变慢。造成这种现象的原因有通风孔被阻塞、连接线松动、风机损坏或不运转、温度传感器损坏、制冷片损坏。经检查发现荧光定量PCR检测不运转，导致散热效果变差，模块降温速度变慢。更换故障风机，机器运转正常。
　　故障5热盖无法加热。造成这种现象的原因有接插件松动、热盖中温度传感器损坏、热盖中加热元件损坏。首先检查接头插件是否松动，然后检测热盖中温度传感器和热盖中加热元件，经测量热盖中温度传感器损坏，更换后仪器使用正常。
　　荧光定量PCR检测在靶基因被扩增的同时检测反应物中的荧光信号的强度，而荧光信号的强度与靶基因的浓度是成比例关系的，通过荧光信号的强度能判断靶基因的浓度。采用光电倍增管检测荧光强度。即通过光电倍增管将反应物的荧光信号逐一检测，通过信号的强弱来区分反应物的荧光强度。荧光定量PCR检测部分中多个滤光片的切换采用了独立步进电机来实现。长寿命的LED激发光源发出激发光，通过滤光片过滤成特定波长的单色光，再通过透镜聚焦成平行光照射在二向分色镜上，二向分色镜上可以反射波长小于一定值的光，因此激发光被设计成可以被二向分色镜反射的单色光，激发光被反射通过透镜聚焦在试管的底部，荧光定量PCR检测特定波长的激发光束使试管内的反应物发出特定波长的荧光，荧光通过透镜照射在二向分色镜上，对于波长大于一定值的光可以穿过二向分色镜，因此荧光设计成可以穿过二向分色镜的波长的光穿过二向分色镜，再被滤光片过滤成特定波长的单色光，zui后被光电倍增管接收变成电信号传输给控制单元。滤光片可以分成多个波长，用于过滤不同波长的荧光。步进电机正反向转动带动同步带运动，从而使固定在同步带上的荧光定量PCR检测左右移动，使其能逐一检测各个试管的荧光，同时通过撞击左右侧面的定位板切换滤光片。
　　荧光定量PCR检测热循环单元置于箱体内的上部，荧光检测单元置于其下部，控制单元位于箱体的后部，它执行数据处理单元通过信号线传输过来的指令信号来控制热循环单元和荧光检测单元按要求工作，同时又将控制热循环单元和荧光检测单元中温度传感器和光电倍增管的信号处理成数字信号通过信号线传输给数据处理单元，荧光定量PCR检测数据处理单元再将这些信号处理成直观易懂的曲线或图表在PC机的显示屏上显示出来。