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miRNA定量检测解读
发布时间:2014-10-14   点击次数:943次
   miRNA定量检测就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。由于miRNA定量检测的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项重要技术,并成为基因表达差异和文章发表不可或缺的部分。miRNA定量检测输出的数据不同于常规PCR电泳检测,很多没有做过miRNA定量检测的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些做过一些实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑。很多时候,尽管知晓qPCR的原理和基本操作,仍然浪费时间和精力,而得不到好的结果或对大量的数据不知所措。
  上海基屹生物科技有限公司的miRNA定量检测技术服务,根据实验目的,设计实验方案(相对定量或定量;SYBR Green I或Taqman探针方法),用完全按照符合国际标准(MIQE)的miRNA定量检测试剂完成实验,提供符合文章发表的客观事实实验报告和原始数据。
  miRNA定量检测是 19~28 nt 的调控RNA分子,主要包括微 RNA(micro RNA,miRNA)和小干涉RNA(short interfering RNA,siRNA)两类,其中的miRNAs成为继 siRNAs之后新的研究热点之一,名列2002年和2003年美国《科学》杂志评出的年度十大科学成就。
  miRNA定量检测中的miRNA是长片段RNA序列的一部分,同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA,一般来源于染色体的非编码区域,由大约70 nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来,miRNA定量检测通过与其目标mRNA分子的3 端非编码区域(3-untranslated region,3 UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制。
  要了解miRNA在基因调控中扮演的角色,很关键的一个方法就是迅速、准确地定量检测miRNA基因的表达。因此,miRNA定量检测表达水平的检测也成为了科学家们研究的热点。但是由于小分子RNA是一类很小的分子,部分小分子RNA表达水平可能很低,因而需要极为灵敏而定量的分析工具。miRNA定量检测常用的检测方法有:
  1.  Northern blotting
  2.  核糖核酸酶保护分析以及基于此方法的液相杂交。
  3.  RT-PCR也被用来miRNA定量检测前体的表达水平, 其他基于PCR技术检测miRNA的方法有引物延伸法,就是在引物的5 末端加一个特异标记,可以定量测定低丰度的RNA含量;原位杂交技术(CISH,FISH)可以方便的检测miRNA的时空表达的差异。
  4.  芯片(microarrays)技术[46,47]是一种较快的研究miRNA表达的方法。
  miRNA定量检测方法克服了由于miRNA分子太短(~22 nt)带来的定量zui大难题而引入靶向特异性的反转录引物,该RT引物可以与成熟miRNA结合,形成反转录引物/成熟miRNA复合物,并在miRNA的5’末端延伸。这样就得到一个较长的反转录扩增因子,为进一步做实时定量PCR提供了符合要求的摸板。

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