腺病毒包装技术中的Z大难点

 　　在目前的腺病毒包装技术中，一直困扰着技术人员的一大难点就是如何将外源基因表达框或者外源的shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上，如果是用现在比较常规的方法即酶切-连接的方式将外源基因或者shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上来进行操作，往往成功率比较低，原因在于：我们知道，腺病毒骨架载体比较大（~30kb），而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，这就造成了低成功率的现象。为此，我们需要采用另外一种方法对其进行包装即用同源重组的方法将外源基因或shRNA表达框构建至腺病毒骨架载体上。
　　重组腺病毒的包装制备：重组腺病毒是从由侵染色斑组成单位（pfu）中分离获得的。一个单色斑是线性载体质粒转染后在20×15 cm板上由293A细胞连续侵染后被挑选和扩增形成的。重组腺病毒可通过超速离心纯化，并测定滴度及进行PCR鉴定。纯化后重组腺病毒的滴定浓度为1010pfu/ml，获得的量为2-4 ml。
　　作为现在比较可靠的重组病毒表达系统，腺病毒可用于哺乳细胞中瞬时及高水平地表达shRNA或目的蛋白，并具有以下优势：
　　1、腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，除可感染几乎所有人的细胞类型外，还可感染包括大鼠、小鼠、兔、猪、羊、猴、鸡等物种。
　　2、因腺病毒的感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞，且病毒滴度高，可用于动物水平的实验。
　　3、腺病毒具有嗜上皮细胞特性，因大多数肿瘤细胞均属于上皮细胞，这使得腺病毒非常适合应用于基因治疗领域。
　　4、有较好的生物安全性。腺病毒携带的基因不会整合到宿主细胞基因组中；实验中虽然会有一定机率出现RCA（即复制型腺病毒），但由于大多数成人体内都有针对腺病毒的抗体，所以一般危害不大。
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