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荧光定量PCR检测技术服务-Taqman探针法

荧光定量PCR检测技术服务-Taqman探针法

简要描述:

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用;实时荧光定量PCR:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,Z后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

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更新时间:2017-02-28

实时荧光定量PCR技术(Real Time Quantitative PCR)

在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,zui后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

相对定量应用(Relative Quantification,RQ)    

 特异性荧光标记:

 TaqMan法

 TaqMan探针的特性:

(1)5′端标记有报告基团(Reporter, R),如FAM、VIC等

(2)3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)

(3)探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ,无荧光, R与Q分开,发荧光

(4)Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针

相对定量通过内标定量:
内标(Endogenous Control)通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因,在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定,受环境因素影响小,内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量。

相对定量分析方法  :

 2-ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且偏差在5%以内
  1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值:
    ΔCT(test)= CT(target,test)-CT(ref,test) 
    ΔCT(calibrator)= CT(target,calibrator)-CT(ref, calibrator) 
  2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值:
         ΔΔCT= ΔCT(test) - ΔCT(calibrator)
  3、计算表达水平比率:
                    2 –ΔΔCT=表达量的比值

服务流程:

步骤

客 户 提 供

服 务 内 容

基 屹 提 供

1

新鲜的且尽量多的材料;已知的全长基因序列;尽可能详细的背景资料:DNA/ RNA来源、丰度等。

DNA/RNA提取,根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。

 

2

纯化好的DNA/RNA(大于5 ug/样品);已知的全长基因序列;尽可能详细的背景资料:DNA/ RNA来源、丰度等。

根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。

 

3

 

以DNA为模板,对目的基因进行荧光定量PCR检测分析

提供完整的定量分析结果、实验荧光定量扩增曲线及详细的实验步骤。

注意:客户可根据所能提供的起始材料不同,选择从步骤1或2启动项目。

       

 

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