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酶切鉴定

酶切鉴定

简要描述:

限制性内切酶是一种工具酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA 的双链,形成一定长度和顺序DNA 片段。对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少酶切片段,因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断酶切口的数目,用已知分子量的线状DNA 为对照,从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

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更新时间:2017-02-28

酶切鉴定

    限制性内切酶是一种工具酶,这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力,能在这个特异性核苷酸序列内,切断DNA 的双链,形成一定长度和顺序DNA 片段。对环状质粒DNA有多少切口,就能产生多少酶切片段,因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数,就可以推断酶切口的数目,用已知分子量的线状DNA 为对照,从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

酶切鉴定操作步骤
1.培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌DH5α接种在LB 琼脂培养基上,37℃培养24~48h。
2.从细菌中快速提取制备质粒DNA。

3.质粒DNA 的酶解
将自提质粒加入20μL 的 TE 缓冲液,使 DNA 完全溶解。取清洁、干燥、灭菌的离心管编号用微量加样器按各种试剂分别加入每个离心管内。
4.DNA酶切加样要求:

   1).选择合适的酶切位点,并找到zui佳缓冲液的酶切Buffer,可保证几乎100%的酶活性.

   2).每小时10-15U/ul的酶可以酶切1ug的质粒DNA,按照比例计算酶的使用量,酶量的加倍,可适当减少酶切时间。

   3).质粒DNA的量通常在反应体系中扩大10倍量,确保酶切完全。1小时内,50μl反应体积中,降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶:DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下,要注意酶的体积不要超过总体积的10%(一般酶都贮存于50%的甘油中)。 

   4).有的酶要求100μg/ml的BSA以实现zui佳活性。在这种情况下,我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 

   5).补无菌双蒸水至相应体系,依实际情况做相应调整,加样后,小心混匀,置于37℃水浴中,酶解2~3h,反应终止后,各酶切样品于冰箱中贮存备用。
5.DNA 琼脂糖凝胶电泳
  (1)琼脂糖凝胶的制备:称取0.6g 琼脂糖,置于三角瓶中,加入50 mL TBE 缓冲液,经微波炉加热全部融化后,取出摇匀,此为1.2%的琼脂糖凝胶。
  (2)胶板的制备:将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液,小心倒入凝胶液,使胶液缓慢展开,直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层,室温下静置30 min,待凝固完全后,轻轻拔出样品槽模板,在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
  (3)加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样品,要用蒸馏水反复洗净微量加样器,以防止相互污染。
6. 电泳
加完样品后的凝胶板,立即通电。样品进胶前,应使电流控制在20mA,样品进胶后电压控制在60~80V,电流为40~50 mA。当指示前沿移动至距离胶板1~2cm 处,停止电泳。
7、结果与观察
在波长为254nm 的紫外灯下,观察DNA 存在处显示出的荧光条带。
 

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