酶切鉴定

酶切鉴定

    限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 的双链，形成一定长度和顺序DNA 片段。对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，用已知分子量的线状DNA 为对照，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。

酶切鉴定操作步骤
1．培养细菌
将带有质粒的大肠杆菌DH5α接种在LB 琼脂培养基上，37℃培养24~48h。
2．从细菌中快速提取制备质粒DNA。

3．质粒DNA 的酶解
将自提质粒加入20μL 的 TE 缓冲液，使 DNA *溶解。取清洁、干燥、灭菌的离心管编号用微量加样器按各种试剂分别加入每个离心管内。
4.DNA酶切加样要求：

   1）.选择合适的酶切位点，并找到*缓冲液的酶切Buffer，可保证几乎100%的酶活性.

   2）.每小时10-15U/ul的酶可以酶切1ug的质粒DNA,按照比例计算酶的使用量，酶量的加倍，可适当减少酶切时间。

   3）.质粒DNA的量通常在反应体系中扩大10倍量，确保酶切*。1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。 

   4）.有的酶要求100μg/ml的BSA以实现*活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 

   5）.补无菌双蒸水至相应体系，依实际情况做相应调整，加样后，小心混匀，置于37℃水浴中，酶解2~3h，反应终止后，各酶切样品于冰箱中贮存备用。
5．DNA 琼脂糖凝胶电泳
  （1）琼脂糖凝胶的制备：称取0.6g 琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 mL TBE 缓冲液，经微波炉加热全部融化后，取出摇匀，此为1.2%的琼脂糖凝胶。
  （2）胶板的制备：将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30 min，待凝固*后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。
  （3）加样：用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。
6． 电泳
加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在60~80V，电流为40~50 mA。当指示前沿移动至距离胶板1~2cm 处，停止电泳。
7、结果与观察
在波长为254nm 的紫外灯下，观察DNA 存在处显示出的荧光条带。