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TA克隆

TA克隆

简要描述:

TA克隆(clone):无性繁殖——应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子(重组子),再通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子,进行扩增、提取获得大量同一DNA,或其表达产物。

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TA克隆实验原理 

  TA克隆是利用耐热聚合酶,如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端转移酶活性,而不具有3 一5外切酶的校准活性,即在PCR产物的两个3 末端加上未配对的单一A凸出尾 ,质粒载体提供线性3末端单一的T凸出尾,使该载体能够直接与PCR产物高效连接。技术比其它PCR克隆方法有更高的重组效率。

只需4个步骤:①扩增目的PCR产物;②制备T克隆载体;③PCR产物直接克隆至T载体上④转化并筛选重组子。

 

实验步骤

(1)扩增后的PCR产物与T载体的连接

取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul

PCR产物约0.3 pmol

T载体约0.03pmol

T4 DNA Ligase 1ul

ddH2O 加至 25ul

*1 DNA的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-10倍。

*2 相同末端的载体与DNA进行连接时,应首先将载体进行去磷酸化处理,以防止其自身环化。

(2)盖好盖子,用手指轻弹Ep管数次,并于台式离心机离心2s 以集中溶液。

(3)将反应管放入4℃金属浴中反应20h。

(4)取出约2ul的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳,鉴定连接结果,与未经连接的质粒DNA和酶切DNA一同作电泳。

(5)用0.1×TE将连接混合物稀释至50ul,使用10ul转化大肠杆菌感受态细胞。

(6)通过Amp抗性来筛选转化子,转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。

 

 

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