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荧光定量PCR检测

荧光定量PCR检测

简要描述:

荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用;实时荧光定量PCR:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,Z后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

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 荧光定量PCR技术与普通PCR的区别:
  理论上PCR是一个指数增长的过程,但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线。
  这是因为随着PCR循环的增多,扩增规模迅速增大,Taq酶、dNTP、引物,甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求,PCR的效率越来越低,产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后,PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制。所以,即使是96次PCR重复实验,各种条件基本一致,所得结果有很大差异,所以在实验过程中我们不能根据zui终PCR产物的量直接计算出起始DNA拷贝数。


  荧光定量PCR的方法:
  荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。而荧光定量 PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类,特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物;而非特异性检测方法是在在PCR反应体系中,加入过量荧光染料,荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。
  荧光定量PCRzui常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法,在这里主要介绍这2种方法,其它方法请参考其它荧光定量PCR资料。
  1、非特异性SYBR Green I染料法
  SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料(结合示意图),在游离状态下,SYBR Green I发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合后,荧光大大增强(作用机理图)。因此,SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
  2、特异性Taqman水解探针法
  Taqman荧光定量技术是以Taqman荧光探针为基础,Taqman荧光探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时,发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;
  PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。从而实现定量(如下图)。常用的荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。

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