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RNA提取

RNA提取

简要描述:

RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质,Z终获得高纯RNA产物的过程。 由于RNA样品易受环境因素特别是RNA酶的影响而降解,提取高质量的RNA样品在生命科研中具有相当的挑战性。对样品的新鲜性要求非常高,获取样品后立即提取RNA,若无条件立即实验,应于-80℃或液氮中。

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更新时间:2017-02-28

RNA提取原理:

    RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质,zui终获得高纯RNA产物的过程。  由于RNA样品易受环境因素特别是RNA酶的影响而降解,提取高质量的RNA样品在生命科研中具有相当的挑战性。对样品的新鲜性要求非常高,获取样品后立即提取RNA,若无条件立即实验,应保存于-80℃或液氮中。

试剂:

    TRIzol,氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)

操作步骤:
1. 匀浆处理:

   a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
   b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
   c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
9. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟,弃上清。
10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥,过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。

注意事项:
    1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响*链的合成,也不影响PCR反应。
   2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
   3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟。
预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。

常见问题分析:
1.得率低:

A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.RNA沉淀未完全溶解
2.后A260/A280<1.65 :

A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B.样品匀浆时加的试剂量太少
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟
D.吸取水相时混入了有机相
E.RNA沉淀未完全溶解。
3.RNA降解:

A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
4.DNA污染:

A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
5.蛋白聚糖和多糖污染:

沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。

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